miR-3074-5p通过靶向TNFSF14参与类风湿关节炎的发生发展

目的本研究旨在通过检测类风湿关节炎外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中TNFSF14(tumor necrosis factor superfamily 14)表达情况,寻找其上游的miRNA,并探讨它们参与RA的可能机制。方法我们通过RT-PCR检测了TNFSF14在22例RA和22例健康人(HCs)PBMCs中的mRNA表达,通过生信分析寻找其上游miRNA,功能学实验和双荧光素酶报告系统验证预测的候选miRNAs。通过计算受试者工作特征曲线(ROC)和斯皮尔曼相关性检验评估miRNA和TNFSF14在RA中的诊断价值。结果 TNFSF14表达水平在RA患者PBMCs中显著降低;生物信息学分析结果预测miR-3074-5p是TNFSF14上游关键调节性miRNA;功能学实验和双荧光素酶报告系统证实TNFSF14是miR-3074-5p的靶基因。miR-3074-5p在RA中上调,且ROC分析提示,miR-3074-5p的表达将RA患者与HCs相区分(AUC为1.00);斯皮尔曼相关性分析说明RA患者PBMCs中miR-3074-5p的表达水平与anti-CCP(抗环瓜氨酸抗体)呈正相关,TNFSF14 mRNA表达水平与RA-IgG、类风湿因子(RF)和DAS28水平呈负相关。结论 miR-3074-5p可能通过靶向TNFSF14抑制TNFSF14的表达,进而参与RA的病理过程,且二者都是RA诊断的潜在分子标记物。

circ-PTPN22在系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞中的翻译及意义

目的探讨circ-PTPN22的翻译能力及其与系统性红斑狼疮(SLE)的关系。方法2019年5月10日至2019年9月30日分别于西南医院中西医结合风湿免疫科和体检中心收集6例SLE女性患者和9例健康女性对照全血样本,分离外周血单个核细胞(PBMC),其中3例SLE和3例健康对照PBMC采用磁珠分选为T、B、NK细胞。通过circRNADb网站预测出circ-PTPN22内部核糖体进入位点(IRES)序列及蛋白序列,制备针对circ-PTPN22剪接位点处特异氨基酸序列的兔抗circ-PTPN22pro多克隆抗体,Western印迹法检测健康对照和SLE患者PBMC以及T、B、NK细胞亚群中circ-PTPN22pro的表达。将circ-PTPN22-FLAG、circ-PTPN22-NC-FLAG、circ-PTPN22-shRNA-FLAG、circ-PTPN22-shRNA-NC-FLAG重组慢病毒分别转染培养的Jurkat细胞,以正常培养的细胞作为细胞对照组,Western印迹法检测Jurkat细胞中circ-PTPN22pro蛋白表达,流式细胞仪检测circ-PTPN22对细胞活化和凋亡的影响。采用两因素重复测量方差分析和两独立样本t检验进行统计分析。结果circRNAD数据库预测显示,circ-PTPN22具有翻译能力,且Western印迹显示circ-PTPN22pro蛋白相对分子质量为20000。转染48 h后,circ-PTPN22-FLAG组circ-PTPN22pro表达明显高于circ-PTPN22-NC-FLAG组和细胞对照组。转染24、48、72 h,circ-PTPN22组白细胞介素2(IL-2)表达(22.20%±8.92%、31.10%±5.88%、53.20%±10.25%)均低于circ-PTPN22-NC组(30.90%±11.00%、51.23%±10.70%、69.67%±9.00%;F=284.881,P=0.003);circ-PTPN22-shRNA组IL-2表达(35.57%±8.79%、78.10%±10.08%、88.63%±3.89%)均高于circ-PTPN22-shRNA-NC组(26.73%±4.92%、41.03%±10.45%、41.33%±4.96%;F=293.818,P=0.003)。转染48、72、96 h后,circ-PTPN22组、circ-PTPN22-shRNA组细胞凋亡率均分别高于circ-PTPN22-NC组(F=81.287,P=0.012)、circ-PTPN22-shRNA-NC组(F=111.813,P=0.009)。SLE组PBMC中circ-PTPN22pro表达低于健康对照组,几乎不表达。SLE组T、B细胞中circ-PTPN22pro表达均显著低于健康对照组(t=3.047、4.806,P<0.05),两组NK细胞中circ-PTPN22pro表达差异无统计学意义(t=0.582,P>0.05)。结论circ-PTPN22可翻译circ-PTPN22pro蛋白,具有抑制Jurkat细胞活化功能,SLE患者PBMC中circ-PTPN22pro表达低于健康对照,提示其与SLE发生发展可能存在一定关系。