fat-1基因脂肪组织特异性表达载体的构建及其山羊转基因细胞系的建立

旨在构建一种筛选标记可全部去除的脂肪组织特异性表达fat-1基因的载体,将其转染山羊胎儿成纤维细胞,筛选出稳定整合fat-1基因的转基因细胞系。首先将人工合成的fat-1基因连接至L28-Wnt10b载体(1种带有小鼠脂肪组织特异性启动子Fabp4的载体)上,构建成fat-1基因脂肪组织特异性表达载体L28-fat1;同时经多次克隆构建成1种筛选标记可全部去除的骨架载体MCS-3s-LoxP-RFP;然后,利用Hind III和Not I对上述2种载体进行双酶切,接着进行连接,构建出筛选标记可全部去除的脂肪组织特异性表达fat-1基因的表达载体。采用脂质体介导的方法转染山羊胎儿成纤维细胞,通过G418筛选转基因细胞。酶切鉴定及PCR检测结果表明,成功构建了3s-LoxP-RFP-FABP4-fat1表达载体,并首次获得了脂肪组织特异性表达fat-1基因的山羊胎儿成纤维转基因细胞系,为将来通过体细胞核移植创制脂肪组织特异表达fat-1基因的优质肉用转基因山羊新材料奠定了基础。

乳腺特异性共表达4种脂肪酸合成酶载体及其稳转山羊成纤维细胞系的构建

为改善山羊乳品质,创制乳汁中富含n-3不饱和脂肪酸的奶山羊育种新材料,首先构建了一种山羊乳腺特异性表达载体,以实现n-3不饱和脂肪酸合通路中4种脂肪酸合成酶基因(fat-1,fads2,elovl5和scd-1)的共表达。为初步验证该载体的有效性,通过脂质体法转染小鼠乳腺上皮细胞系C127,经G418筛选收集阳性C127转基因细胞,并对其进行反转录PCR(RT-PCR)检测。结果表明,4种基因均可在C127细胞转基因中表达。将该多基因共表达载体转染奶山羊成纤维细胞,通过G418筛选获得了稳定转染的细胞系。PCR结果显示,4个目的基因均成功整合到奶山羊成纤维细胞基因组中。总之,本研究成功构建了乳腺特异性共表达4种脂肪酸合成酶转基因载体及其山羊转基因细胞系,为创制乳腺特异性表达多不饱和脂肪酸的转基因奶山羊奠定了基础。