生淀粉水解α-淀粉酶AmyZ1热稳定性提升的分子改造

生淀粉水解α-淀粉酶是一种具有生淀粉水解能力的α-淀粉酶,能够在淀粉糊化温度以下降解生淀粉颗粒,适用于淀粉冷水解。ΑmyZ1是来源于海洋微生物的生淀粉水解酶,其催化底物转化应用时热稳定性不足。与热稳定α-淀粉酶结构进行比对分析,发现AmyZ1在结构域B区域多了一个柔性loop区。通过同源建模,确定突变位点,构建缺失柔性区的突变酶AmyZ1∶ΔTG,并对突变酶的酶学性质、Ca^(2+)依赖以及水解高浓度玉米生淀粉的能力进行分析。AmyZ1∶ΔTG最适作用温度为45℃,在35℃~55℃范围内酶活力维持在60%以上。在30℃和35℃条件下,半衰期可分别达到18 h和15 h,是出发酶AmyZ1的10倍和15倍。突变酶AmyZ1∶ΔTG蛋白结构的柔性降低,导致AmyZ1∶ΔTG的催化效率有所降低。与出发酶AmyZ1相比,AmyZ1∶ΔTG的催化性能受外源Ca^(2+)的影响较小,酶活力对外源Ca^(2+)的依赖有所降低,但Ca^(2+)有助于提升其热稳定性。此外,在35℃的作用条件下,AmyZ1∶ΔTG对300 g/L玉米生淀粉的水解率为40%,接近于出发酶AmyZ1。

糖苷水解酶GH97家族成员PspAG97A的催化机制分析

糖苷水解酶GH97家族是一个特殊的家族,同时拥有反转和保留两种催化类型成员,其两种催化类型如何分化目前还不清楚。对GH97家族成员PspAG97A的催化机制进行分析,通过高效液相色谱法检测水解产物异头物的构型,根据在不同酶反应时间所检测到的α-葡萄糖与β-葡萄糖的比例变化,证明PspAG97A执行反转催化机制。通过结构分析与定点突变等方法尝试对PspAG97A的催化类型进行改造,将PspAG97A与同一家族成员Bt GH97b(保留型)活性中心进行叠加比较,仿照保留类型的催化装置对相关位点G407、E377及E456进行单点突变和联合突变。结果显示突变酶活力相比野生型显著下降,并分析了相关位点的作用。研究加深了对PspAG97A催化机制的认识,为GH97家族两种催化类型进化关系的研究奠定基础。

漆酶Lcc9在灰盖鬼伞菌中的同源过表达

为了高效制备漆酶Lcc9,克隆了Lcc9编码基因,利用酿酒酵母同源重组技术构建lcc9过表达载体并在Corprinopsis cinerea Okayama 7#130(OK7)和FA2222中进行同源过表达。经原生质体共转化、再生培养基初筛、最简培养基复筛,分别获得46株OK7和29株FA2222阳性转化子。摇瓶发酵结果显示,在Kjalke培养基中接种5%(体积分数),经37℃培养6~7 d后,OK7阳性菌株漆酶活力达到5.1~21.1 U/mL,FA2222阳性菌株漆酶活力达到3.7~12.3 U/mL,分别为野生型表达量的19.2和241.2倍。在3 L发酵罐中对FA2222阳性菌株进行漆酶的发酵制备,结果显示,经37℃、50 r/min培养108 h后菌株漆酶活力达59 U/mL,相比普通摇瓶发酵,漆酶活力进一步提高了4.8倍。

鉴定隶属于糖苷水解酶13家族(glycoside hydrolase family 13,GH13)的潮滩发光杆菌的β-半乳糖苷酶

【背景】糖苷水解酶13家族(glycoside hydrolase family 13,GH13)是已知最大的α-淀粉酶家族,不含有半乳糖苷酶。【目的】对海洋细菌潮滩发光杆菌(Photobacterium gaetbulicola)的一个蛋白BgalPg进行鉴定。【方法】通过保守位点分析和系统发育树确定BgalPg蛋白的家族分类;通过克隆、表达和纯化测定重组BgalPg蛋白的酶学性质并鉴定功能。【结果】BgalPg的蛋白序列新颖,与已知的碳水化物酶无同源性。序列分析结果表明该蛋白具有GH13家族的典型特性,并且隶属于GH13_38亚家族。BgalPg对α-淀粉酶家族酶的相关底物均无催化活性,却能水解含有β-半乳糖苷键的底物pNP-β-Gal[(2.8±0.4)U/mg]和oNP-β-Gal[(1.4±0.3)U/mg],并且能水解乳糖[(0.40±0.01)U/mg],表现出典型的β-半乳糖苷酶活性。同时,该酶在pH 7.0–8.5稳定性好,60℃的半衰期为1.5 h。【结论】发现隶属于GH13家族的β-半乳糖苷酶。