治疗用卡介苗抑瘤小鼠模型的建立及其作用机制研究

目的探讨治疗用卡介苗对小鼠膀胱癌细胞的体内抑制作用。方法将治疗用卡介苗菌悬液与小鼠膀胱癌细胞悬液等体积混合,皮下接种C57BL/6J小鼠,3周后,取皮下实体瘤,称重计算抑瘤率;同时取C57BL/6J小鼠脾脏,酶联免疫斑点试验检测分泌抗原特异性干扰素γ、白介素2细胞斑点数。结果不同浓度治疗用卡介苗组的瘤体质量均显著低于模型对照组(P=0.000),当治疗用卡介苗为10mg·ml^(-1)和5mg·ml^(-1)时,肿瘤生长抑制率均高于90%,当治疗用卡介苗为2.5mg·ml^(-1)时,肿瘤生长抑制率均高于70%,呈明显的剂量依赖性;且干扰素γ、白介素2细胞斑点数均显著高于模型对照组(P=0.000)。结论成功建立了治疗用卡介苗皮下抑瘤小鼠模型,其抗肿瘤作用的产生可能是通过激活Th1型免疫反应提高细胞分泌干扰素γ和白介素2的水平,从而促进细胞介导的免疫应答。

重组Omicron BA.4/5-Delta株新冠疫苗体外相对效力检测方法的建立及验证

目的建立重组Omicron BA.4/5-Delta株新冠疫苗体外相对效力的检测方法,并进行验证,以期为替代体内效力检测奠定基础。方法以人源单克隆抗体GH4作为包被抗体,HRP标记的CB6人源单克隆抗体作为酶标抗体的双抗体夹心ELISA法为基础,确定疫苗解吸附方法;再以该解吸附方法结合双抗体夹心ELISA法建立体外相对效力检测方法。并验证方法的线性范围、专属性、准确性、精密性、耐用性及定量限。采用建立的方法检测3批供试品重组Omicron BA.4/5-Delta株新冠疫苗的体外相对效力。结果确定解吸附方法为:将疫苗与处理液(1.25 mL 20%二乙醇胺,0.20 mL 10%Triton X-100,8.55 mL PBS)按等体积分数混合,于25℃解离30 min,解吸附率可达95%以上。疫苗参考品在1~26 ng/mL浓度范围内,与A_(450)呈良好的线性关系,线性方程为log(y)=1.447 log(x)-1.643,R^(2)为0.998;可特异性检测疫苗参考品的体外相对效力;90000、50000和20000 ng/mL浓度疫苗参比品检测结果的回收率均在80%~120%范围内;重复性及中间精密性验证相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均<20%;解离条件、检测体系孵育时间和显色时间发生微小变动时,检测结果不受影响;定量限为0.2。批号为J202301002、J202301003、J202301004供试品的体外相对效力分别为1.0,1.0和0.8,RSD为11%。结论建立的用于检测体外相对效力的方法具有良好的准确性、精密性、专属性和耐用性,可用于重组Omicron BA.4/5-Delta株新冠疫苗体外相对效力的检测。

基于刺突糖蛋白受体结合区的重组SARS-CoV-2疫苗抗原含量双抗体夹心ELISA检测方法的建立及验证

目的 建立基于刺突糖蛋白(S蛋白)受体结合区(receptor-binding domain,RBD)的重组SARS-CoV-2疫苗抗原含量的双抗体夹心ELISA检测方法,并进行方法验证。方法 以GH4人源单克隆抗体为包被抗体,HRP标记的CB6人源单克隆抗体(CB6-HRP)为检测抗体,建立双抗体夹心ELISA法,确定GH4(500、1 000、2 000 ng/mL)及CB6-HRP(3.906 25~500 ng/mL)的工作浓度,并对方法进行线性范围、准确性、精密性、专属性和耐用性验证。采用建立的方法检测3批重组SARS-CoV-2疫苗(CHO细胞)原液的抗原含量。结果 GH4及CB6-HRP的工作浓度分别为1 000和31.25 ng/mL。原液参比品在0.488~125 ng/mL范围内与A450呈良好的线性关系,R~2均> 0.99;准确性验证的回收率在87.2%~120.5%之间;重复性和中间精密性验证的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均<20.0%;专属性验证的错误率在-16.6%~2.1%之间;耐用性验证的RSD均<20.0%。3批疫苗原液抗原含量分别为638.9、592.4、664.8 ng/mL,RSD为5.8%。结论 建立的基于S蛋白RBD的双抗体夹心ELISA检测方法具有良好的准确性、精密性、专属性和耐用性,可用于重组SARS-CoV-2疫苗抗原含量的检测,为该疫苗的质量控制奠定了基础。

重组结核分枝杆菌Ag85b蛋白原液纯度反向高效液相色谱检测方法的建立及验证

目的 建立检测重组结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)Ag85b蛋白原液纯度的反向高效液相色谱法,并进行验证。方法 设计4因素3水平正交试验,将面积、拖尾因子、峰面积、峰面积RSD作为评价指标进行分析,摸索最适检测条件,并依据《中国药典》四部(2020版)9101药品质量标准分析方法验证指导原则进行专属性、线性范围、精密度、耐用性等验证。结果 当检测条件为有机相洗脱比例30%~95%、检测温度35℃、进样量3μg、95%有机相洗脱时间15 min时,各评价指标结果均较好,在该检测条件下线性相关系数(R2)为0.998 5,线性范围为1.8~4.2μg;重复性RSD为0.01%;中间精密度RSD为0.16%;在柱温与流速细微变动下均具有良好的耐用性。结论 建立了重组MTBAg85b蛋白原液纯度检测的反向高效液相色谱法,该方法专属性强,精密度、耐用性好,可用于重组MTBAg85b蛋白原液质量控制。

超声截留灌流培养重组CHO细胞工艺优化

目的采用超声截留控制器超声使得细胞聚集、沉降的方法截留悬浮细胞,优化重组CHO细胞灌流培养工艺。方法基于无血清化学限定(CD)培养基,选择表达水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)糖蛋白E(VZV gE)的重组CHO细胞在5 L生物反应器中灌流培养。对初步确定的培养条件进行响应面分析,优化培养温度、培养基pH、灌流速度;并采用上述优化条件验证超声截留控制器灌流培养重组CHO细胞工艺。结果本实验条件下,优化后的灌流培养条件为:温度33.2℃、pH 7.0、灌流速度4.1 mL/min。3批验证结果显示,相较批培养,灌流培养时间延长5~7 d,收获体积增加5~7倍。其中,葡萄糖和乳酸含量、细胞密度和活性批间变化趋势一致;细胞截留效率均高于90%,批间差异无统计学意义(P>0.05);目的蛋白比活性约为0.5,批间差异无统计学意义(P>0.05);Western blot结果显示,相对分子质量和糖基化修饰与批培养一致。结论实现了5 L生物反应器灌流培养重组CHO细胞表达gE蛋白工艺,为后续大规模生产提供了依据。