荧光定量PCR检测c-Met CAR病毒感染T细胞的效率

目的:通过设计特异性引物,应用荧光定量PCR方法检测c-Met CAR病毒感染T细胞的效率。方法:应用基因重组技术构建c-Met CAR(GFP)逆转录病毒质粒。应用病毒包装技术制备c-Met CAR病毒与c-Met CAR(GFP)病毒,感染T细胞制备c-Met CAR-T细胞与c-Met CAR-T(GFP)细胞。Western blot检测c-Met CAR和c-Met CAR(GFP)在293T细胞中表达的外源性CD3ζ蛋白。设计特异性引物应用荧光定量PCR检测CAR病毒对T细胞的感染效率,并与流式细胞术的检测结果进行比较。结果:构建c-Met CAR(GFP)质粒,荧光显微镜可观察到c-Met CAR(GFP)质粒在293T细胞上表达绿色荧光蛋白。c-Met CAR和c-Met CAR(GFP)病毒感染的293T细胞可表达外源性CD3ζ蛋白。荧光定量PCR检测c-Met CAR与c-Met CAR(GFP)的感染效率分别为(52.1±1.7)%、(55.9±2.3)%。流式细胞术检测c-Met CAR(GFP)病毒感染效率为(50.7±3.6)%,两种检测方法比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:通过设计特异性引物,应用荧光定量PCR方法能够特异性检测CAR病毒对T细胞的感染效率,该检测方法结果准确、安全,对CAR-T细胞的临床应用具有实用价值。

靶向Trop-2 CAR-T细胞的制备及其体外对卵巢癌细胞杀伤作用的研究

目的:制备靶向人滋养层细胞表面抗原2(human trophoblast cell surface antigen 2,Trop-2)的嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cell,CAR-T),观察Trop-2 CAR-T细胞在体外对卵巢癌细胞增殖的影响。方法:运用分子克隆及基因重组技术构建Trop-2 CAR;采用Western blot检测Trop-2 CAR在293T细胞中的表达;CCK-8法检测Trop-2 CAR-T细胞对卵巢癌细胞增殖的影响;ELISA检测细胞因子分泌的变化。结果:酶切鉴定及测序分析结果表明,Trop-2 CAR各基因片段连接正确;Western blot检测结果显示,该质粒能够在293T细胞中有效表达;CCK-8结果显示,制备的Trop-2 CAR-T细胞在体外能明显抑制表达Trop-2的卵巢癌细胞的增殖(P<0.05);ELISA检测结果表明Trop-2 CAR-T细胞与表达Trop-2的卵巢癌细胞共培养后,干扰素(interferon-γ,IFN-γ)、白介素(interleukin-2,IL-2)细胞因子分泌增加(P<0.01)。结论:该研究成功制备了Trop-2 CAR-T细胞,可有效抑制Trop-2表达阳性的卵巢癌细胞的增殖。

CAR-T治疗复发难治B细胞淋巴瘤的安全性及临床疗效分析

目的:探讨第3代CD19单靶点、CD20单靶点或CD19联合CD20双靶点嵌合型抗原受体T淋巴细胞(CAR-T)治疗复发难治B细胞淋巴瘤的安全性及临床疗效。方法:对14例CD20单抗及传统化疗治疗无效的B细胞淋巴瘤患者,预处理后5~7天输注自体特异性CD19和(或)CD20 CAR-T细胞,观察评价临床疗效及不良反应。结果:①14例患者中,1例因病情进展联合接受放化疗不能评价,其余13例可评价的患者采用CD19单靶点CAR-T细胞治疗,3例获得完全缓解,2例获得部分缓解,客观反应率为38.5%,完全缓解率为23.1%。1例接受单靶点CAR-T细胞治疗无效的患者,再次输注CD19联合CD20双靶点CAR-T细胞,获得完全缓解且维持疗效超过2年。②13例可评价的患者中,11例输注CAR-T细胞后发生1~2级细胞因子风暴,给予糖皮质激素或对症处理未造成不良后果。结论:CAR-T疗法为复发难治性终末期B细胞淋巴瘤提供了一种新的安全、有效的治疗方案;治疗过程中可能出现细胞因子风暴等可控的不良反应;对于单靶点CAR-T细胞治疗无效的患者可尝试采用双靶点CAR-T细胞治疗,有望获得完全缓解。