重组葡激酶溶栓作用的实验研究

目的 研究重组葡激酶对体内外血栓的溶解作用。方法 采用体外纤维蛋白溶解法，家兔体内纤维蛋白溶解试验，胶原蛋白肾上腺素诱发小鼠体内脑血栓形成模型及静脉结扎形成大鼠下腔静脉血栓模型。结果 重组葡激酶体外给药对纤维蛋白具有显著溶解作用，使家兔血浆优球蛋白溶解时间明显缩短，给药后０－５至２ｈ间血浆鱼精蛋白试验均呈阳性反应，但对血浆纤维蛋白原含量无显著影响；可显著降低脑血栓小鼠死亡率，缩短偏瘫动物的恢复时间；对结扎形成的大鼠下腔静脉血栓湿重有明显降低，给药后血栓所占血管面积明显减少。结论 重组葡激酶具有极显著溶解体内外血栓的作用，等剂量条件下，作用优于尿激酶。

重组葡激酶致突变作用研究

目的 研究重组葡激酶的致突变作用。方法 CHL细胞染色体畸变试验 (±S9) ,剂量为 412 5、82 5 0、165 0 0AU/ml、Ames试验 (±S9) ,剂量为 16 5、165、165 0、165 0 0、165 0 0 0AU/ml)和小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验 (肌肉注射剂量为83 5、167 0、334 0mg/kg)。 结果 CHL细胞染色体畸变率均小于 5 % ;各剂量组TA97、TA98、TA10 0 、TA10 2 各试验菌株MR<2 ;各剂量组小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率均小于 2 0 0‰。

重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体对猕猴的长期毒性研究

目的 观察重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(reteplase,Ret)的长期毒性作用。 方法 连续 14d给猕猴静脉注射不同剂量Ret。结果 Ret 8 0MIU·kg-1对猕猴不表现任何毒性作用 ,Ret 2 5 0、80 0MIU·kg-1组的血液RBC、HGB及HCT均降低 ,部分猕猴粪便隐血试验阳性 ,血液生化学检查有TP下降 ,但这些指标在停药 14d时基本恢复正常。另外 ,所有给药猕猴出血时间均延长 ,但脏器系数和病理学未见有毒性变化。结论 Ret静脉注射 8 0MIU·kg-1是安全剂量 ,2 5 0、80 0MIU·kg-1两个剂量有一定的毒性反应 ,主要表现为贫血和出血 ,停药后毒性可以恢复。

rhIL-10对银屑病动物模型的治疗作用及免疫功能的影响

目的 研究重组人白细胞介素 10 (rhIL 10 )对银屑病动物模型的治疗作用以及免疫功能的影响。方法 用小鼠雌激素期阴道上皮模型、鼠尾鳞片表皮模型观察重组人白细胞介素 10的抗银屑病作用 ,并检测ConA诱导T淋巴细胞增殖、LPS诱导B淋巴细胞增殖、NK细胞活性及细胞因子(IFN γ、IL 2、IL 1、TNF α)水平。结果 rhIL 10 (5 ,2 0 ,80μg·kg-1·d-1,sc)对小鼠阴道上皮细胞有丝分裂有抑制作用 ,促进小鼠尾鳞片颗粒层的形成。对ConA诱导T淋巴细胞增殖反应及IL 2、IFN γ产生有抑制作用 ;对LPS诱导小鼠腹腔巨噬细胞产生IL 1、TNF α具有抑制作用 ;对NK细胞活性有抑制作用 ;对LPS诱导B淋巴细胞增殖有促进作用。结论 rhIL 10可能是通过抑制表皮细胞增殖与促进其分化 。

rhIL-10对银屑病患者与正常人PBMC作用比较

目的 研究重组人白细胞介素 1 0 (rhIL 1 0 )对银屑病患者与正常人外周血单个核细胞 (PBMC)产生细胞因子与一氧化氮 (NO)的影响 ,探讨rhIL 1 0治疗银屑病机制。方法 分离、培养银屑病患者与正常人PBMC ,并检测PHA诱导PBMC产生IL 2、IFN γ与LPS诱导PBMC产生IL 1、IL 6、IL 8和NO水平。结果 银屑病患者活化的PBMC产生IFN γ、IL 1、IL 6和IL 8的水平明显高于正常健康人 ,IL 2与NO水平也较正常人为高 ,提示银屑病活动期一些炎性细胞因子水平升高。rhIL 1 0 (2 5、5、1 0、2 0、40 μg/L)对PHA诱导的银屑病患者与正常人PBMC产生IL 2、IFN γ均有抑制作用 ,对LPS诱导银屑病患者与正常人PBMC产生IL 1、IL 6、IL 8和NO同样具有抑制作用 ,并呈明显剂量依赖关系。anti IL 1 0McAb(2 5、5、1 0、2 0、40mg/L)在rhIL 1 0存在与不存在情况下均能促进PHA活化的银屑病患者与正常健康人PBMC产生IL 2及IFN γ ,但银屑病患者PBMC产生上述细胞因子能力低于正常人。结论 rhIL 1 0对银屑病患者PBMC分泌的炎性细胞因子水平升高具有抑制作用 。

rhIL-10对小鼠T淋巴细胞及NK细胞活性的影响

目的 研究ｒｈ Ｉ Ｌ１０ 对小鼠免疫功能的影响。方法 用 Ｍ Ｔ Ｔ 还原法检测 Ｃｏｎ Ａ 诱导的 Ｔ 淋巴细胞增殖试验，中性红染色法检测 Ｎ Ｋ 细胞活性。结果 ｒｈ Ｉ Ｌ１０ 能抑制小鼠 Ｔ 淋巴细胞及 Ｎ Ｋ 细胞活性（ Ｐ＜ ００１） ，这种抑制作用随剂量增加而加强。结论 ｒｈ Ｉ Ｌ１０ 能抑制小鼠 Ｔ 淋巴细胞及 Ｎ Ｋ 细胞活性，并呈剂量依赖关系。

重组葡激酶及其在大肠杆菌中高效表达与纯化

目的 研究高效表达葡激酶载体的构建及其体外表达与产物的纯化。方法 用PCR方法扩增葡激酶cDNA ,插入质粒pET 2 2b中构建成表达载体 ,转化入大肠杆菌BL2 1(DE3) ,经IPTG诱导表达 ,表达产物用Q Poros和S Sepharose纯化。 结果 经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定证明所构建质粒为葡激酶重组质粒 ,体外表达产物经离子交换纯化后HPLC纯度达 98%以上 ,SDS PAGE和WesternBlot实验证实该产物为葡激酶。结论 成功构建了重组葡激酶表达载体 ,并经表达纯化获得高纯度葡激酶 ,为产业化和临床应用奠定了良好基础。

重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体的溶栓作用及对血小板聚集和胞浆游离钙离子浓度的影响

目的 研究重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(reteplase,Ret)的溶栓作用以及对离体家兔血小板聚集功能和对血小板静息状态胞浆内游离钙浓度的影响。方法 家兔血栓模型采用动-静脉旁路法,血小板聚集实验采用比浊法,血小板静息状态胞浆内游离钙浓度采用Fura-2荧光测定法。结果Ret(3.75×105,7.50× 105,15.0×105U·kg-1)对家兔动-静脉旁路所形成的血栓有明显溶栓作用,可明显减轻血栓干湿重量,并呈一定的剂量依赖性。Ret(1 000,3 000,10 000 U·mL-1)对ADP诱导的血小板聚集可产生浓度依赖性的抑制作用,并可明显降低血小板静息状态的[Ca2+]i,并呈一定的浓度依赖性。结论Ret具有明显的血栓溶解作用,可明显抑制ADP诱导的血小板聚集,并明显降低血小板静息状态的[Ca2+]i。

重组人白细胞介素10对角朊细胞增殖及产生细胞因子的影响

目的 :研究重组人白细胞介素 10 (rhIL 10 )对无血清培养的角朊细胞增殖和产生细胞因子的影响 ,探讨其治疗银屑病的作用机制。方法 :用四甲基偶氮唑蓝比色法 (MTT)测定其对细胞增殖的影响 ;小鼠胸腺细胞增殖法检测白细胞介素 1(IL 1) ;ELISA法检测白细胞介素 6 (IL 6 )、白细胞介素 8(IL 8)。结果 :重组人白细胞介素 10抑制角朊细胞增殖与IL 1、IL 6及IL 8的分泌 ,并呈剂量依赖关系。结论 :重组人白细胞介素 10抑制角朊细胞与细胞因子分泌 ,可能是治疗银屑病的作用机理之一。

重组葡激酶对犬股动脉血栓的再通作用

目的 研究重组葡激酶对体内血栓的溶解作用。方法 采用狗股动脉富含红细胞血栓形成模型。结果 重组葡激酶明显减少狗股动脉富含红细胞血栓的长度及湿重，促进栓塞动脉再通，给药后，动脉血流量明显增加，再通率提高。结论 重组葡激酶具有极显著溶解犬实验性动脉血栓的作用，等剂量条件下。

MTT法检测重组人内抑素对人内皮细胞增殖的影响

目的 探讨观察重组人内抑素对人血管内皮细胞增殖影响的方法。方法 采用MTT法观察不同浓度重组人胎儿内抑素是否对碱性成纤维细胞生长因子刺激的人血管内皮细胞系ECV增殖产生抑制作用。结果 MTT法分析显示细胞活力与光密度改变之间存在线性关系 ,重组人内抑素可抑制胎儿血管内皮细胞ECV的增殖 ,半数抑制浓度约为 3 5 0mg·L-1。结论 MTT法检测重组人内抑素对人血管内皮细胞增殖的抑制作用准确可靠、操作简便。

重组人白细胞介素10单克隆抗体的制备

目的 制备重组人白细胞介素 10 (rhIL 10 )单克隆抗体。方法 应用鼠 鼠杂交瘤技术建立分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系 ,ELISA检测杂交瘤细胞培养上清、腹水效价 ,双向免疫扩散试验进行亚类鉴定 ,Giemsa染色镜下计数杂交瘤染色体数目。结果 获得了 2株能分泌抗rhIL 10单克隆抗体的杂交瘤细胞系 (1D3、2A3) ,无血清培养液效价为 1∶5 12、1∶2 5 6 ,腹水效价 1∶10 5、1∶10 4 。单克隆抗体为IgG2 亚类 ,染色体数目 98～ 10 3条。 2株杂交瘤细胞体外传代培养6个月以上 ,ELISA检测抗体滴度无明显降低。结论 制备的 2株单克隆抗体效价高 。

二连体人干细胞因子基因的构建及其在昆虫细胞中的表达

应用DNA重组技术构建两端为人干细胞因子 (hSCF) 1～ 16 5肽编码区 ,中间为柔性连接肽 (GGGGSGGGGSGG)编码区的头尾相连的二连体基因 (dSCF) ,并将其插入杆状病毒转移载体 pVL1392中 .重组转移载体 pVL1392 dSCF与野生型苜蓿夜蛾核型多角体病毒AcNPVDNA共转染草地贪夜蛾细胞Sf9,经胞内同源重组和 4轮筛选获得纯净的重组病毒AcNPV dSCF .重组病毒感染Sf9单层培养细胞时 ,主要以分泌形式表达二连体蛋白 ,经MTT比色法测得dSCF的表达量约为 1180units/3× 10 6cells .WesternBlotting鉴定了昆虫细胞表达的重组人二连体干细胞因子 (rhdSCF) ,两种主要产物的分子量分别为 4 0kDa、4 9kDa .

重组葡激酶对实验性猫冠状动脉血栓的影响

目的 研究重组葡激酶对实验性冠状动脉血栓的溶栓作用。方法 采用实验性猫冠状动脉血栓形成模型。结果 重组葡激酶显著降低猫冠脉血栓切面与冠脉管腔比值 ,减少心肌缺血范围 ,给药后对心电图也有一定程度的改善。

人内抑素在大肠杆菌中表达纯化及其抗肿瘤效应

血管内皮细胞抑制素(简称内抑素,Endostatin)是XⅧ见胶元C端片段蛋白,分子量为20Kd,主要是通过抑制血管内皮细胞的生长和肿瘤血管的形成来达到抑制肿瘤的作用.内抑素对各种肿瘤模型均具有极强的抑制效果,且无耐药性和毒副作用,因此该药已成为肿瘤治疗的一个崭新的治疗途径和新药开发热点.我们通过PCR的方法先从人胚肝cDNA库中扩增得到0.54Kb的内抑素基因片段,将其克隆入pETz原核表达载体中,得到pET/ENDO重组表达质粒,将该质粒导入BL21宿主菌后进行诱导表达,结果表明:经IPTG诱导后,细菌表达的重组内抑素蛋白量占菌体蛋白的50%以上.将工程菌进行扩大培养和诱导,按常规提取包含体的方法制备包含体蛋白,所得蛋白的纯度即可达90%以上.将粗蛋白固定在肝素-Scpharosc 6B柱上脱脲,氧化复性,然后用NaCI洗脱即得到重组内抑素纯品,纯度大于95%.以ECV304人胚胎血管内皮细胞为靶细胞,用MTT微量法测定重组内抑素的生物学活性。

重组人内抑素对内皮细胞增殖的影响

目的 探讨原核表达的可溶性重组人内抑素(rhEndo)对ECV 30 4内皮细胞和原代培养兔主动脉内皮细胞增殖的影响。方法 利用酶标仪进行噻唑蓝 (MTT)法检测 ,同时采用倒置相差显微镜、电子显微镜、流式细胞仪、半胱天冬酶 3活性分析观察该内抑素对碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)刺激的血管内皮细胞增殖的影响。结果 该rhEndo明显抑制ECV 30 4细胞的增殖 ,MultiCycleDNACycle软件分析表明细胞增殖阻滞在G1期 ,流式细胞仪检测发现该内抑素可诱导ECV 30 4细胞凋亡 ,且与半胱天冬酶 3活性增强有关 ,但对原代培养的兔主动脉内皮细胞增殖并未产生明显的作用。结论 内抑素可明显抑制ECV 30 4细胞增殖并诱导其发生凋亡 ,但对原代培养的兔主动脉内皮细胞增殖没有明显的影响 ,这将有利于与血管新生有关的疾病如癌症等的治疗。

重组人内抑素抑制佐剂性关节炎大鼠滑膜组织中新生血管生成及机制

目的观察重组人内抑素(recombinant human endostatin,rh-End)对佐剂性关节炎(adjuvant-induced arthritis,AA)大鼠滑膜组织新生血管生成的抑制作用及其部分机制研究。方法采用弗氏完全佐剂(Freund's complete adjuvant,CFA)诱导的AA大鼠模型,观察滑膜组织中新生血管生成的病理学改变;免疫组织化学法检测血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达。实时荧光定量PCR对VEGF的表达进行定量检测。结果rh-End能抑制AA大鼠的继发性足肿胀,对滑膜组织中过度生成的新生血管有抑制作用。rh-End能显著减少AA大鼠关节滑膜组织中高表达的VEGF。结论重组人内抑素可显著抑制AA大鼠滑膜组织VEGF的表达及新生血管生成。