孔扩散-CAS法检测铁载体及其在捕食线虫真菌中的作用

基于传统CAS检测法,改良原有操作,规避CAS检测液对真菌生长的抑制作用,以实现真菌产铁载体的有效定性分析。以捕食线虫真菌少孢节丛孢菌(Arthrobtrys oligospora)为研究对象,通过比较三种不同处理方式下,即覆盖CAS(O-CAS)法、CAS区域法以及孔扩散CAS(WD-CAS)法,少孢节丛孢菌生长及铁载体检出情况,确定最佳铁载体检测方法。对少孢节丛孢菌不同生活方式条件下产铁载体情况进行分析,验证该方法在解决实际生物学问题中的应用效果,并初步探究少孢节丛孢菌产铁载体特征。结果表明,三种处理方式均能实现对少孢节丛孢菌中铁载体的有效检测,相比O-CAS法,CAS区域法以及WD-CAS法能够更好地规避CAS检测液对真菌生长的抑制作用,其中的WD-CAS法整体表现效果最佳,能很好的在少孢节丛孢菌从腐生生活方式转变为寄生生活方式后实现对铁载体合成情况的有效监测。少孢节丛孢菌具有多种铁载体合成能力,且合成的铁载体种类因培养时间和培养基组成的不同而有所差异。WD-CAS法不仅能够避免因CAS检测液对微生物生长抑制造成的检测困难,还可以实现检测液的实时添加,保证检测结果的准确。研究结果为微生物中铁载体的高效检测及进一步研究铁载体在捕食线虫真菌捕杀线虫中的功能提供参考。

灰盖鬼伞中过表达的碱性真菌漆酶在高盐染料废水中的应用潜力

【目的】本研究利用双孢菇(Agaricus bisporus)gpdII启动子,实现了碱性真菌漆酶PIE5(CcPIE5)在灰盖鬼伞(Coprinopsis cinerea)FA2222中的同源过表达。【方法】在mKjalke液体培养基中37℃培养7 d,漆酶活力达到(24.2±1.1)U/mL。纯化的CcPIE5在pH 8.0和60℃下表现出最佳催化活性。【结果】与已经研究报道的真菌漆酶不同,CcPIE5能耐受高浓度NaCl,当NaCl浓度从0升至1.5 mol/L时,CcPIE5的k_(cat)和K_(m)均呈下降趋势,表示CcPIE5在纺织印染废水脱色中有潜在应用价值。进一步在染料废水脱色应用中,以丁香酸作为介体,CcPIE5在pH 8.5和60℃条件下可高效降解(92.9±2.3)%的靛蓝胭脂红。通过LC-MS分析确认,Isatin 5-sulfonic acid(ISA)是靛蓝胭脂红降解的主要副产物。【结论】CcPIE5在高温、碱性和含盐条件下高效脱色染料,是处理环境和工业特定应用的理想选择。

半理性改造提升细菌漆酶Lac15的催化活性

【目的】漆酶可氧化各种底物,在多个工业领域有很好的潜在应用价值。Lac15是一种微生物漆酶,已表现出可观的应用潜能,可望通过蛋白质工程改造提升和拓展其应用。【方法】通过基于结构分析的半理性改造策略,选取推测与电子/质子转移或底物结合直接或间接相关的位点进行定点突变,并测定突变酶对各种底物的活性及酶学性质。【结果】部分突变体对某些底物的活性显著提升,其中D216N对ABTS的催化效率提高了1.0倍,R178V和K433T对多巴胺的催化效率分别增加了1.2和11.1倍。同时,这些突变体保留了野生型酶在应用中的优点如中性最适pH和盐促活等性质。【结论】利用基于结构的半理性改造方法,可改善漆酶Lac15对某些底物的活性。漆酶中的一个保守Asp,对应于Lac15中的D216,可作为提升以ABTS为底物或介体时漆酶活性的一个共同改造目标。