结核分枝杆菌分泌性酸性磷酸酶(SapM)抑制小鼠巨噬细胞自噬

目的研究结核分枝杆菌分泌性酸性磷酸酶(Sap M)对小鼠巨噬细胞自噬的影响。方法分别用Sap M、渥曼青霉素、饥饿处理GFP-LC3-Raw264.7细胞。荧光显微镜下观察自噬体的形成,Western blot法检测微管相关蛋白1轻链3(LC3)Ⅱ水平;再用Sap M处理GFP-LC3-Raw264.7细胞后加氯喹,Western blot法检测LC3Ⅱ水平。结果 Sap M和饥饿均导致GFP-LC3斑点增多和LC3Ⅱ水平增高,在Sap M处理的细胞中加入氯喹并没有引起LC3Ⅱ的进一步升高。结论 Sap M可阻断自噬体与溶酶体的融合,从而抑制小鼠巨噬细胞自噬。

结核分枝杆菌感染的巨噬细胞的死亡和自噬

结核分枝杆菌(MTB)是一种兼性细胞内寄生菌,能将单核/巨噬细胞内物质转化为对其自身生存有利的成分。在结核病中细胞凋亡有助于机体保护作用,包括消除病原菌的复制环境、促使体液免疫对游离病原菌产生免疫应答以及增强抗原提呈作用。细胞坏死未显示抗MTB免疫保护作用。巨噬细胞的自噬诱导能有效杀伤MTB,巨噬细胞与MTB通过自噬产生复杂的对话机制。因此,开展MTB诱导的宿主细胞应答机制研究有可能被用于结核病的防治。本文主要总结了MTB感染巨噬细胞死亡和自噬的研究现状。

钛合金表面纳米化对成骨细胞生物学行为的影响

采用表面机械研磨(SMAT)方法对Ti-25Nb-3Mo-3Zr-2Sn(TLM)钛合金进行处理,并将处理前后的钛合金样品表面机械抛光成镜面,制备出Un SMATed及SMATed两组样品。XRD、OM、TEM、AFM及接触角试验结果显示,两组样品表面具有相同的物相组成、相近的拓扑结构及粗糙度,最表层的晶粒尺度分别为(82±9)μm及(48±7)nm,且晶粒细化后的SMATed样品表面具有更好的亲水性;体外试验结果显示,SMATed样品的纳米晶表面能从血清中吸附更高的蛋白量,从而促进其上成骨细胞的黏附、增殖与分化。结果表明,SMAT诱发的表层晶粒细化改善了TLM钛合金表面的细胞生长环境,从而有望应用于新型医用硬组织替代材料的开发。

钛合金表面微粗糙化对成骨细胞黏附及增殖行为的影响

采用表面机械研磨(SMAT)法对Ti-25Nb-3Mo-3Zr-2Sn(TLM)钛合金处理15min,而后将处理前后的钛合金样品与成骨细胞共培养1h、24h。采用X射线衍射(XRD)、光学显微镜(OM)、透射电镜(TEM)、扫描电镜(SEM)、电子能谱(EDX)及激光共聚焦显微镜(CLSM)对处理前后样品表面的结构进行了分析,结果显示SMAT处理不会改变TLM钛合金的物相、晶粒尺度及化学组成,处理前后物相均由单一的β相组成,晶粒尺寸均在10~20μm且没有引入新的杂质元素,但SMAT处理会改变TLM钛合金的表面粗糙度,处理前的样品表面平整,平均粗糙度Ra为(0.2±0.03)μm,而处理后的样品表面坑洼不平,平均粗糙度Ra增至(2.6±0.4)μm。随后的细胞实验结果显示,对比SMAT处理前,成骨细胞在处理后的微粗糙表面铺展得更为充分,增殖得更加迅速。研究表明,SMAT处理可以改善TLM钛合金表面的成骨细胞生长环境,从而为开发出更符合临床应用的钛金属种植体提供新的思路。

SapM诱导的自噬体-溶酶体融合阻断依赖于SapM和Rab7的相互作用

目的研究Rab7在结核分枝杆菌毒力因子分泌性酸性磷酸酶(SapM)诱导的自噬体-溶酶体融合阻断中的作用。方法采用Rab7小干扰RNA(si Rab7)转染Raw264.7细胞,Western blot法检测P62蛋白水平。m Cherry-SapM转染Raw264.7细胞后免疫荧光检测SapM与Rab7共定位情况,免疫共沉淀分析SapM与Rab7的关系。用3种SapM的突变体SapM△ARCA,SapM△FRED和SapM△CT转染Raw264.7细胞,分析SapM的不同突变体与Rab7的关系。结果 si Rab7处理后,细胞P62水平显著增高;免疫组织化学染色结果显示SapM与Rab7在胞内共定位;免疫共沉淀分析显示SapM与Rab7可相互沉淀;3种不同突变形式的SapM中,只有SapM△CT不能与Rab7相互作用。结论 SapM诱导的自噬体-溶酶体融合阻断依赖于SapM与Rab7的相互作用。

6 kD早期分泌型抗原靶点(ESAT6)抑制巨噬细胞的自噬并促进BCG的增殖

目的 6 kD早期分泌型抗原靶点(ESAT6)能够促进卡介苗(BCG)的增殖,巨噬细胞的自噬功能能有效杀伤BCG,研究ESAT6与自噬的相互作用,为揭示ESAT6介导的免疫逃逸提供实验依据。方法分别观察对照质粒pCMV-HA和重组质粒pCMV-HA-ESAT6转染以及Earle平衡盐溶液(EBSS)处理的小鼠RAW264.7巨噬细胞中BCG的生长情况,Western blot法检测转染pCMV-HA-ESAT6的RAW264.7细胞0、8、12、24、32 h后,微管相关蛋白1轻链3(LC3)蛋白水平。转染pCMV-HA、pCMV-HA-ESAT6、氯喹(CQ)单独处理和CQ与pCMV-HA-ESAT6转染联合处理条件下,Western blot法检测LC3的水平,Lyso Tracker Red染料法计数溶酶体数量,观察罗琴培养基上BCG的情况。结果 pCMV-HA-ESAT6转染的RAW264.7细胞中BCG的生长旺盛,而EBSS处理组生长受抑制;在0、8、12、24、32 h,pCMV-HA-ESAT6转染的RAW264.7细胞中LC3Ⅰ向LC3Ⅱ转换逐渐增强;与对照组相比,溶酶体荧光探针Lyso Tracker Red染色法显示pCMV-HA-ESAT6、CQ以及CQ与pCMV-HA-ESAT6转染处理组的溶酶体较多且体积大,但后三组间均无显著性差异;pCMV-HA-ESAT6、CQ以及CQ与pCMV-HA-ESAT6转染处理组的BCG生长旺盛。结论 ESAT6抑制RAW264.7细胞内的自噬水平,并且能够促进RAW264.7细胞中感染BCG的生长。