靶向La的外源性microRNA抑制HBV复制和表达的实验研究

目的设计并构建靶向La的microRNA表达载体,观察其对La基因的抑制作用,探讨其在HBV感染基因治疗中的应用价值。方法以La为靶基因,设计并构建3个针对La不同位点的microRNA表达载体,通过脂质体方法转染HepG2.2.15细胞,RT-PCR和Western blot检测其对La mR-NA和蛋白的抑制作用,乙肝五项定量和HBV DNA检测其对HBV的抑制作用。结果 3个外源性miRNA(amiRNA)均能明显降低La mRNA和蛋白的表达,其中amiRNA-La-1130抑制效应最强,转染后72h La mRNA和蛋白的水平平均下降了58.6%和50.6%(P<0.01);但仅有amiRNA-La-1130质粒能显著抑制相应细胞株中HBsAg和HBeAg的分泌,抑制率为23.3%和25.8%(P<0.01),HBV DNA的平均抑制率为22.3%(P<0.01)。结论靶向La的amiRNA能显著抑制靶基因的表达,进而抑制HBV的复制和表达。La基因可作为慢性HBV感染联合基因治疗的候选靶点之一。

青蒿琥酯体外抗弓形虫作用的实验研究

目的:观察青蒿琥酯(Artesunate,Art)对体外培养的弓形虫感染模型的抑制作用。方法:采用表达绿色荧光蛋白的转基因弓形虫RH株(RH-GFP)感染小鼠腹腔巨噬细胞(Macrophage,Mφ),建立体外作用模型并分为对照组(0.9%氯化钠溶液阴性对照);Art组,药物浓度分别为1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50、100和200μg/mL;阿奇霉素(Azithromycin,Azm)组(阳性对照),药物浓度分别为12.5、25、50、100、200、400、800和1600μg/mL;Art+Azm组,药物浓度分别为:Art1.5625+Azm12.5、Art3.125+Azm25、Art6.25+Azm50、Art12.5+Azm100、Art25+Azm200和Art50+Azm400μg/mL。各组孵育24 h后以流式细胞仪检测感染体系中虫体和细胞比例变化,以吉姆萨染色观察速殖子形态和结构变化。结果:与对照组相比,Art组弓形虫速殖子比例自3.125μg/mL起随着药物浓度的增加明显下降(P<0.01),50μg/mL时游离虫体比例低于0.3%,Mφ感染率低于1.6%。Azm组速殖子在400μg/mL时比例低于0.6%,Mφ感染率低于3.5%。Art+Azm组中Art12.5+Azm100μg/mL起速殖子比例低于0.04%,此时Mφ感染率低于1.8%。吉姆萨染色显示,各组随着药物浓度增加,弓形虫速殖子由香蕉状逐渐肿胀变形,细胞质内呈泡沫状,内部结构崩塌瓦解,直至细胞膜破裂内容物溢出,视野内仅残留固缩深染的胞核或碎片。结论:体外实验中,Art可显著杀伤弓形虫游离速殖子,降低宿主细胞感染率,该抗虫效果在一定范围内与浓度呈正相关。

MHC分子多态性的起源、演变与抗病机理

主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex,MHC)的概念源于解释异体间组织排斥和相容现象,现已拓展为与抗感染以及所有免疫反应相关的基因群。MHC是现有物种形成前就存在的原始基因。在进化过程中,MHC基因在物种之间和种群的个体之间都产生了明显差异。物种之间的差异主要是基因结构的不同,如有无基因框架和高度可塑性区、单一或重复基因座,还包括等位基因的排列方式以及不同数量的基因座和等位基因。亲缘关系较近的物种之间MHC基因结构相近,其差异表现在有无基因组单元重排方式和假基因。同种动物的MHC等位基因表现高度多态性序列。MHC基因是脊椎动物多态性最高的基因,其遗传基础是等位基因的点突变,即核苷酸发生替换。产生MHC多态性的原因主要是环境中病原压力。许多研究已经探明了与特定病原抗病相关的MHC的单倍型或MHC分子中的特定位点。MHC分子中肽结合区(Peptide binding region,PBR)是多态性最高的区段,PBR和抗原肽之间的亲和力与动物的抗病性/易感性关系最密切。分子生物学和生物信息学技术提供了研究MHC多态性,特别是探明MHC与抗原肽互相作用机理的理想工具。

基于单克隆抗体的三聚氰胺ELISA检测方法的建立

建立三聚氰胺直接和间接竞争ELISA检测方法。三聚氰胺(melamine)-BSA免疫BALB/c小鼠,通过融合小鼠脾细胞与SP2/0细胞,制备分泌MEL单克隆抗体(monoclonal anti-body)的细胞株;体内诱生腹水制备MEL-mAb。用高碘酸钠法制备MEL-OVA-HRP偶联物并对其活性进行鉴定。分别用MEL-OVA和制备的MEL-mAb包被,用三聚氰胺标准液作为抑制物,做直接和间接竞争ELISA,并对两种ELISA方法在灵敏度、线性检测范围、检测时间进行比较。筛选出4株可以稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株。其中的C4株腹水效价达到1∶104,亲和力常数(Ka)为2.92×108L/mol。三聚氰胺间接竞争ELISA和直接竞争ELISA检测法的IC50分别为3.12μg/L和56.88μg/L,线性检测范围分别为0.05～10μg/L和0.1～1 000μg/L。两种竞争ELISA方法都能应用于三聚氰胺的快速检测,但间接竞争ELISA比直接竞争ELISA更加灵敏。

一株分泌抗猪γ-干扰素单克隆抗体的杂交瘤细胞的鉴定

[目的]应用杂交瘤技术获得稳定分泌抗猪γ-干扰素单克隆抗体的杂交瘤细胞株。[方法]先将原核表达产物His-PoIFN-γ免疫BALB/c小鼠4次,然后进行细胞融合,再以纯化的GST-PoIFN-γ作为包被抗原,用间接ELISA筛选阳性杂交瘤无性系,最终获得能稳定分泌抗猪IFN-γ单克隆抗体的杂交瘤细胞株,对其进行间接ELISA和Western blot检测。[结果]试验获得1株能稳定分泌抗猪IFN-γ单克隆抗体的杂交瘤细胞株,被命名为B3株,经间接ELISA和Western blot检测,该株分泌的抗体能与融合蛋白His-PoIFN-γ和GST-PoIFN-γ发生特异性反应,而与其他表达鸡γ-干扰素、His和GST蛋白等的重组质粒均不发生反应。B3株分泌的抗体小鼠腹水的ELISA效价达到1∶160 000,抗体亚型为IgG1型,且轻链为κ链。[结论]该研究为建立猪γ-干扰素检测方法,研究机体的免疫状态及免疫机制提供了技术基础。

靶向ASGPR1的外源性microRNA对HBV表达和复制的抑制作用

目的:设计并构建ASGPR1靶向的microRNA表达载体,观察其对ASGPR1基因的抑制作用及其在HBV感染基因治疗中的应用价值.方法:以ASGPR1为靶基因,设计并构建3个针对ASGPR1不同位点的microRNA表达载体,通过脂质体方法转染HepG2.2.15细胞,RT-PCR和Western blot检测其对ASGPR1mRNA和蛋白的抑制作用,乙肝五项定量和HBVDNA检测其对HBV的抑制作用.结果:ASGPR1mRNA和蛋白的平均水平分别下降了57.3%和49.8%(P<0.01);在病毒水平3种amiRNA均能明显抑制相应细胞株中HBsAg和HBeAg的分泌,其中以a miRNA-ASGPR1-610抑制作用最强,对培养72h的细胞上清中的HBsAg和HBeAg抑制率分别为31.3%和33.6%(P<0.01),HBV DNA的抑制率为29.7%(P<0.01).结论:靶向ASGPR1的外源性microRNA能显著抑制靶基因的表达,进而抑制HBV的复制和表达.ASGPR1可以作为慢性HBV感染基因治疗的候选靶点.

三种重组蛋白混合抗原的间接ELISA法检测人血清弓形虫IgM和IgG抗体

目的比较弓形虫rSAG1、rHXGPRT和rAK三种重组蛋白作为混合抗原在弓形虫病血清免疫诊断中检测结果与进口试剂盒检测结果的差异,评价三种重组蛋白混合抗原检测在弓形虫病免疫诊断中的应用价值。方法收集经美国产Zeus Toxo-ELISA试剂盒筛选的阳性血清136例,阴性血清30例。复苏、诱导、表达含有弓形虫pET-28a/SAG1,pET-28a/HXGPRT和pET-28a/AK表达载体的3个菌株,纯化3种重组蛋白。以3种混合蛋白作为诊断抗原,采用间接ELISA法,以正交叉方法优化检测条件,检测66例弓形虫IgM阳性、70例IgG例阳性血清和30阴性血清,比较混合抗原检测和Zeus Toxo-ELISA试剂盒检测结果的差异;以Zeus Toxo-ELISA弓形虫试剂盒检测结果为标准,评价重组蛋白混合抗原检测的敏感性、特异性、总符合率以及约登指数。结果 IgM:混合抗原与Zeus Toxo-ELISA试剂检测结果经χ2检验,χ2值为3.12,P>0.05,差异无显著性。混合重组抗原的敏感性为89.4%,特异性为96.7%,总符合率为91.7%,约登指数为0.861。IgG:混合抗原与Zeus Toxo-ELISA试剂检测结果经χ2检验,χ2值为0.25,差异无显著意义(P>0.05)。采用混合重组抗原的敏感性为97.1%,特异性为93.3%,总符合率为96.0%,约登指数为0.904。结论本研究3种重组抗原(rSAG1+rHXGPRT+rAK)混合的间接ELISA法检测弓形虫IgM和IgG,与进口ELISA试剂检测的总符合率高,具有较高的敏感性、特异性;更经济。

褪黑素对大鼠肝纤维化的影响及部分机制研究

目的探讨褪黑素(melatonin,MEL)对大鼠肝纤维化的影响及部分机制。方法 111只雄性SD大鼠随机分为6组:正常对照组、模型对照组、N-乙酰-L-半胱氨酸组(N-ac-etyl-L-cysteine,NAC)组、褪黑素低、中、高剂量组(剂量分别为2.5、5、10 mg.kg-1)。采用四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)制备大鼠肝纤维化模型,同时腹腔注射褪黑素,HE染色和VG胶原纤维染色观察肝脏病理改变;生化法测定肝脏丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPx)、超氧化物歧化酶(superox-ide dismutase,SOD)活性;RT-PCR法测定肝组织中α1(I)前胶原(α1(I)procollagen)mRNA表达;原位灌注加密度梯度离心法分离正常SD大鼠肝脏星状细胞,在培养的肝星状细胞中加入脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)进行刺激,用MTT法测定不同浓度的MEL对肝星状细胞增殖的抑制作用。结果和模型组比较,MEL(10 mg.kg-1)组肝纤维化评分较低(P<0.05),MEL能明显降低肝匀浆MDA含量,升高SOD、GPx活性,MEL(10 mg.kg-1)组、NAC组大鼠肝组织α1(I)型前胶原mRNA表达明显减少(P<0.05);培养的肝星状细胞经LPS刺激后A值增大,与LPS组相比,LPS+NAC组和LPS+MEL(0.1 mmol·L-1)组A值明显减小(P<0.05)。结论 MEL对大鼠肝纤维化具有改善作用,其机理可能与抗氧化、抑制前胶原基因转录和抑制肝星状细胞增殖有关。

弓形虫的基因型及其主要效应分子的致病机制

弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种广泛寄生于人和温血动物有核细胞内的顶复门原虫(Apicomplexan),具有复杂的生活史和致病机制。Toxoplasma属下仅此一个虫种,但对其种群遗传结构的研究表明,世界各地的弓形虫存在着丰富的遗传多样性。采用PCR-限制性片段长度多态性分析(RFLP)或微卫星标记分型,已从野生动物、家养禽畜和人体分离虫株中发现了232个基因型。其中,北美的弓形虫基因型以typeⅡ、typeⅢ和type12(主要见于野生动物)为主;欧洲以typeⅡ、typeⅢ和typeⅠ为主;非洲以typeⅡ和typeⅢ为主。以上称为原型克隆谱系。但南美的弓形虫表现出丰富的遗传多样性,包括BrⅠ、BrⅡ、BrⅢ和BrⅣ型等。近年研究发现,我国流行的弓形虫优势基因型为Chinese 1型(Toxo DB#9)。该型虫株兼具有原型谱系虫株关键效应分子的多态性。本文综述了世界各地包括我国在内的基因型、宿主免疫应答及其致病特点,为深入研究基因型/效应分子相关的致病机制,以及弓形虫的生物学和流行病学研究提供借鉴。

外源性microRNA介导的RNA干扰抑制HBV复制和表达

目的设计并构建靶向HBV的外源性microRNA表达载体,观察其对HBV表达和复制的抑制作用。方法以HBVP基因和X基因为靶基因,根据pcDNA6.2-G/W-miR载体要求,设计靶向HBV的microRNA序列,进行直接合成获得目的片段并克隆到载体中,测序正确的载体通过脂质体方法转染HepG2.2.15细胞,RT-PCR、乙肝五项定量和荧光定量PCR检测其对HBVmRNA和HBVDNA的抑制作用。结果质粒的转染效率为50%～60%,在这种状态下,外源性microRNA表达载体在HBVmRNA和HBsAg、HBeAg和HBVDNA水平上均能显著抑制HepG2.2.15细胞中HBV的复制和表达(P<0.05)。结论外源性microRNA表达载体构建成功,并能抑制HBV靶基因的表达,为其在慢性HBV感染基因治疗中的应用奠定了基础。

药用真菌葡聚糖免疫调节作用的研究进展

药用真菌含有多种对人体有益的生理活性物质,具有多种药用功能,其中真菌多糖所具有的免疫调节作用倍受关注。该文在阐述真菌多糖分子结构与生物学活性关系的基础上,主要综述了葡聚糖在免疫调节中的作用机制及药用真菌多糖的免疫调节功能。

弓形虫腺苷激酶基因的克隆、表达及多抗血清的制备

目的克隆弓形虫RH株腺苷激酶(AK)基因,构建原核表达载体pET28a/AK,表达AK重组蛋白,利用此重组蛋白免疫新西兰白兔制备多抗血清。方法收集、纯化弓形虫RH株速殖子,提取总RNA。设计合成的引物并引入BamHI和XhoI酶切位点,应用RT-PCR扩增弓形虫AK基因片段,目的基因插入克隆载体pGEM-T,提取重组质粒,BamHI和XhoI双酶切获得目的基因,插入原核表达质粒pET28a中,重组子双酶切、PCR和测序鉴定,转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)并以IPTG诱导表达。亲和层析法纯化重组蛋白抗原,SDS-PAGE和Western blotting验证表达量和免疫活性,免疫新西兰白兔,收集多抗血清,ELISA测定多抗滴度,Western blotting鉴定免疫活性。结果从弓形虫RH株cDNA中扩增出1 092bp的AK目标基因片段,并构建原核表达载体,诱导含pET28a/AK的宿主菌获得了高浓度、与预期分子量大小相符的表达产物,经Ni2+亲和层析法纯化获得了高纯度的rAK蛋白,Western blotting显示rAK能够被TORCH试剂盒中的Tox-IgG阳性控制血清识别,获得了纯化的重组蛋白。rAK蛋白免疫新西兰白兔,获得滴度为1∶106多价抗血清。结论成功地从弓形虫RH株基因组DNA中获取了AK基因,构建了pET28a/AK重组质粒,并获得了高效表达,免疫新西兰白兔获得了高效价多克隆抗体,为弓形虫iRNA及弓形虫病的免疫诊断奠定了基础。

鸡Ⅰ类抗原递呈分子亚单位与恒定链的细胞定位及相互关系研究

目的:研究鸡Ⅰ类抗原递呈分子亚单位和鸡恒定链的细胞定位及相互关系。方法:RT-PCR获得鸡MHCⅠ类分子α、β2m亚单位,并进一步构建了能表达红色和绿色荧光蛋白的α、β2m亚单位的真核表达载体,利用脂质体介导法与能表达增强型绿色荧光的Ii真核表达载体共转染COS-7细胞,荧光显微镜检测Ii与MHCⅠ亚单位的细胞定位,并通过免疫共沉淀进一步研究它们之间的相互关系。结果:GFP-Ii与MHCⅠα-RFP、MHCⅠβ2m-RFP在细胞中共表达后出现共定位现象,且共定位于细胞的内膜系统;免疫共沉淀结果显示,只有当GFP-Ii链与MHCⅠα-GFP、MHCⅠβ2m-GFP三者共转染后,才可以检测到MHCⅠα-GFP、MHCⅠβ2m-GFP的表达。结论:鸡Ii与单个的MHCⅠα、MHCⅠβ2m亚单位不能有效结合,Ii只有与完整的Ⅰ类抗原递呈分子才能够形成复合体,且共定位于细胞的内膜系统。

高纯度日本血吸虫卵的分离及活性鉴定

目的探讨制备高纯度、高生物活性的的日本血吸虫卵分离方法。方法将匀浆后的血吸虫感染的兔肝组织悬液分级过滤,再将滤液离心,去除组织碎片,分离的虫卵再次经过325目分样筛过滤,收集筛上虫卵,最后将收集的虫卵用密度1.070的Percoll分离液梯度离心,吸取下层Percoll液中的纯化虫卵;显微镜观察分离虫卵的纯度,吖啶橙染色观察虫卵的死活,环卵沉淀试验鉴定虫卵的分泌活性。结果每个肝脏获得约1g左右的虫卵,分离的虫卵纯度高,吖啶橙染色和环卵沉淀试验结果显示,分离的活虫卵比例高、生物活性好。结论该虫卵分离方法操作简单、用时短、效果好,分离的虫卵完全满足各种研究的需要。

蠕虫及虫源性分子对自身免疫性疾病的保护作用

机体接触包括蠕虫在内的病源微生物机会减少,尤其在幼年时期免疫系统失去病源微生物的塑造和协调,是导致西方发达国家自身免疫性疾病和过敏性疾病发病率迅速增高的主要原因之一。蠕虫感染能激发强烈的Th2免疫应答,可以改善Th1介导的自身免疫性疾病的临床症状和病理过程。日益增多的流行病学及实验研究证实了蠕虫对自身免疫性疾病及过敏性疾病的保护作用,显示了优异的临床应用价值。蠕虫感染能激发强烈的Th2免疫应答,可以改善Th1介导的自身免疫性疾病的临床症状和病理过程。目前,蠕虫感染诱导的宿主Th2免疫偏移已成为感染免疫调节研究的重要模型,并显示了优异的临床应用价值,具有诱人的临床应用前景。然而其负向免疫调控的机制至今尚未明了。本文回顾近年来蠕虫及其分子调节自身免疫性疾病的国内外研究进展,着重探讨蠕虫感染及其分子发挥免疫抑制作用的可能机制。

鲍曼不动杆菌108株β-内酰胺酶检测及耐药分析

目的:分析鲍曼不动杆菌的医院感染分布特点、产β-内酰胺酶情况和耐药性。方法:对临床送检标本中分离出的108株引起医院感染的鲍曼不动杆菌分布及药敏结果进行回顾性分析,并分别采用硝基头孢噻吩纸片法、双纸片协同法、三维试验检测β-内酰胺酶、超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)和头孢菌素酶。结果:鲍曼不动杆菌在重症监护治疗病房、神经外科的检出率分别为63.89%、11.11%;感染部位以呼吸道和手术切口为主,分别为77.78%和12.96%。该菌对临床常用抗生素有不同程度的耐药,发现多重耐药菌96株(88.89%)。108株鲍曼不动杆菌中共检出产ESBLs 11株,阳性率为10.19%;头孢菌素酶78株,阳性率为72.22%;产β-内酰胺酶阳性率为100.00%。结论:鲍曼不动杆菌是医院感染重要的条件致病菌,其对抗生素耐药率高,且多重耐药。产β-内酰胺酶为鲍曼不动杆菌耐药的主要原因之一。临床要重视合理使用抗生素,减少多重耐药菌株的产生。

猪γ干扰素基因的克隆表达及其抗原性的初步研究

为研究猪γ干扰素(poIFN-γ)的生物学活性及其在机体免疫应答中的作用机理,克隆并表达了猪IFN-γ基因。首先应用RT-PCR方法通过一对自行设计的引物从猪脾脏淋巴细胞中扩增了猪γ干扰素基因片段,分别将其定向插入原核表达载体pGEX-4T-1和pET-32 a中,经测序表明与已报道的核苷酸序列同源性为100%。接着将重组质粒pGEX-poIFN-γ和pET-poIFN-γ分别转化大肠杆菌BL21株,经IPTG诱导,得到高效表达。所表达的融合蛋白均以不溶性的包涵体形式存在,分子量分别为43.0和35.0 ku,与理论推算值相符。为研究IFN-γ在表达中结构的变化,采用上述2种融合蛋白分别作为免疫抗原和检测抗原。结果用GST-poIFN-γ免疫小鼠所诱导的抗体可与poIFN-γ产生特异性结合,表明不同原核质粒表达的猪IFN-γ仍保持其特有的结构。

恒定链辅助肿瘤免疫逃逸的研究进展

恒定链（Invariant chain,Ii）属于Ⅱ型跨膜糖蛋白,在MHCⅡ类分子与抗原肽复合物的装配过程中发挥重要作用。在内质网中,Ii在calnexin辅助下形成三聚体,然后与MHCⅡ类分子的α和β链形成九聚体,占据Ⅱ类分子的抗原肽结合槽,阻止内源性抗原肽的结合,与MHCⅡ类分子聚合后将其靶向定位到内体中。此外,Ii还能与MHCⅠ类分子结合,辅助MHCⅠ类分子进行抗原的交叉呈递[1]。

姜黄素对弓形虫感染小胶质细胞NO的产生及iNOS表达的影响

目的研究姜黄素(curcumin)对弓形虫PRU虫株(type II基因型)感染的BV-2细胞一氧化氮(NO)的产生及诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)表达的影响。方法用弓形虫PRU虫株(5×105)感染BV-2细胞,同时用姜黄素进行干预,观察细胞形态;MTT检测细胞增殖;用Griess法检测细胞上清中NO的含量;Western blotting检测iNOS蛋白的表达。结果与对照组相比,感染弓形虫的小胶质细胞胞体变圆,突起减少,姜黄素可以减轻这种改变。弓形虫感染的小胶质细胞iNOS的表达增强,NO释放量增加,且随着时间延长逐渐增高,姜黄素能抑制iNOS的表达和NO的产生。结论姜黄素可以抑制弓形虫感染的BV-2细胞iNOS蛋白表达和NO的产生,提示该药对弓形虫脑病具有潜在的治疗价值。