靶向La的外源性microRNA抑制HBV复制和表达的实验研究

目的设计并构建靶向La的microRNA表达载体,观察其对La基因的抑制作用,探讨其在HBV感染基因治疗中的应用价值。方法以La为靶基因,设计并构建3个针对La不同位点的microRNA表达载体,通过脂质体方法转染HepG2.2.15细胞,RT-PCR和Western blot检测其对La mR-NA和蛋白的抑制作用,乙肝五项定量和HBV DNA检测其对HBV的抑制作用。结果 3个外源性miRNA(amiRNA)均能明显降低La mRNA和蛋白的表达,其中amiRNA-La-1130抑制效应最强,转染后72h La mRNA和蛋白的水平平均下降了58.6%和50.6%(P<0.01);但仅有amiRNA-La-1130质粒能显著抑制相应细胞株中HBsAg和HBeAg的分泌,抑制率为23.3%和25.8%(P<0.01),HBV DNA的平均抑制率为22.3%(P<0.01)。结论靶向La的amiRNA能显著抑制靶基因的表达,进而抑制HBV的复制和表达。La基因可作为慢性HBV感染联合基因治疗的候选靶点之一。

靶向ASGPR1的外源性microRNA对HBV表达和复制的抑制作用

目的:设计并构建ASGPR1靶向的microRNA表达载体,观察其对ASGPR1基因的抑制作用及其在HBV感染基因治疗中的应用价值.方法:以ASGPR1为靶基因,设计并构建3个针对ASGPR1不同位点的microRNA表达载体,通过脂质体方法转染HepG2.2.15细胞,RT-PCR和Western blot检测其对ASGPR1mRNA和蛋白的抑制作用,乙肝五项定量和HBVDNA检测其对HBV的抑制作用.结果:ASGPR1mRNA和蛋白的平均水平分别下降了57.3%和49.8%(P<0.01);在病毒水平3种amiRNA均能明显抑制相应细胞株中HBsAg和HBeAg的分泌,其中以a miRNA-ASGPR1-610抑制作用最强,对培养72h的细胞上清中的HBsAg和HBeAg抑制率分别为31.3%和33.6%(P<0.01),HBV DNA的抑制率为29.7%(P<0.01).结论:靶向ASGPR1的外源性microRNA能显著抑制靶基因的表达,进而抑制HBV的复制和表达.ASGPR1可以作为慢性HBV感染基因治疗的候选靶点.

外源性microRNA介导的RNA干扰抑制HBV复制和表达

目的设计并构建靶向HBV的外源性microRNA表达载体,观察其对HBV表达和复制的抑制作用。方法以HBVP基因和X基因为靶基因,根据pcDNA6.2-G/W-miR载体要求,设计靶向HBV的microRNA序列,进行直接合成获得目的片段并克隆到载体中,测序正确的载体通过脂质体方法转染HepG2.2.15细胞,RT-PCR、乙肝五项定量和荧光定量PCR检测其对HBVmRNA和HBVDNA的抑制作用。结果质粒的转染效率为50%～60%,在这种状态下,外源性microRNA表达载体在HBVmRNA和HBsAg、HBeAg和HBVDNA水平上均能显著抑制HepG2.2.15细胞中HBV的复制和表达(P<0.05)。结论外源性microRNA表达载体构建成功,并能抑制HBV靶基因的表达,为其在慢性HBV感染基因治疗中的应用奠定了基础。