hipA对禽致病性大肠杆菌生物学特性和致病性的影响

【目的】探究毒素-抗毒素(TA)系统中毒素基因hipA对禽致病性大肠杆菌(APEC)生物学特性和致病性的影响,为深入研究TA系统和APEC的致病机制提供理论依据。【方法】利用Red同源重组方法,构建禽致病性大肠杆菌野生株AE81的hipA基因缺失株AE81ΔhipA及回复株C-AE81ΔhipA,测定其生长曲线、运动性、环境耐受能力、细胞黏附能力,并采用实时荧光定量PCR检测环境耐受相关基因(hdeA、hdeB)、黏附相关基因(fimF、fimH)、毒力相关基因(hcp、ompR、ompC)的转录水平,探究毒素蛋白hipA对APEC的生物学功能及致病性的影响。【结果】成功构建hipA基因的缺失株和回复株。野生株AE81、缺失株AE81ΔhipA和回复株C-AE81ΔhipA的生长情况无明显差异。与野生株AE81相比,hipA基因缺失株AE81ΔhipA的运动能力降低,对酸性、碱性、高渗和氧化应激环境的耐受能力减弱,鞭毛和菌毛的数量和长度明显减小,对鸡胚成纤维细胞(DF-1)的黏附能力极显著减弱(P<0.01),回复株C-AE81ΔhipA各指标基本恢复到野生株水平。实时荧光定量PCR结果显示,与野生株AE81相比,AE81ΔhipA菌株的hdeA、hdeB、fimF、ompR、ompC基因转录水平显著降低(P<0.05),hcp基因转录水平差异不显著,但fimH转录水平显著升高(P<0.05)。【结论】TA系统毒素蛋白hipA影响APEC的运动性、环境耐受能力和对细胞的黏附能力,参与APEC的致病过程。

基于宏基因组学分析安徽地区畜禽粪便微生物耐药性特征

目的为深入了解在食用动物生产过程中滥用抗生素,迫使肠道共生细菌成为微生物耐药性(antimicrobial resistance,AMR)重要宿主之一的现象,本研究利用宏基因组学针对食用动物的肠道细菌AMR进行分析。方法利用宏基因组学技术对安徽地区猪和鸡粪便中的AMR及可移动遗传元件进行定量和表征,并且在核心抗性基因亚型水平上研究猪和鸡共生细菌群落的耐药性特征。结果从抗性基因(antimicrobial resistance gene,ARG)的丰度和多样性来看,鸡肠道共生菌中ARG的多样性和检出率高于猪,而猪肠道共生菌中ARG总丰度高于鸡。大环内酯―林可酰胺―链菌素类抗性基因和四环素抗性基因是所有样本中含量最高的2种ARG,研究也检测到了世界范围内流行的ARG,包括optrA、qnrS、lsaE和tem等,同时,一些可移动遗传元件,包括噬菌体、质粒和插入序列也显示出与ARG存在一定相关性,这揭示了ARG的水平转移潜力。此外,食物链动物的抗性组和微生物组之间在统计学上也被证明存在正相关性。宿主溯源分析表明,在鸡样本中的拟杆菌和大肠埃希菌被检测出含有大量ARG,而在猪的样本中被检测出含有丰富ARG的为瘤胃球菌和罗氏菌。结论本研究通过对猪和鸡共生细菌群落中AMR的调查统计,证实肠道微生物群是ARG的重要宿主及传播途径之一,为评价食用动物安全性及后续泛耐药基因数据库的构建提供科学依据,对公共健康具有重要意义。

鸡cGAS基因的克隆、表达特性分析及FAdV-4感染前后亚细胞定位变化

cGAS作为一种新型的胞质DNA受体,在宿主抵抗DNA病毒而触发的天然免疫中起着至关重要的作用。血清4型禽腺病毒(Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)是无囊膜的一种双链DNA病毒,可引起鸡肝炎-心包积液综合征。为明确鸡cGAS(chcGAS)基因功能,探究在鸡肝癌(LMH)细胞中过表达chcGAS以及FAdV-4感染前后细胞定位的变化情况。本研究针对chcGAS序列设计引物进行PCR扩增,并分析该基因序列与其他物种之间的同源性以及预测该基因的结构域,构建重组质粒pET-32a-chcGAS进行原核表达,通过SDS-PAGE和Western blot鉴定,利用激光共聚焦观察FAdV-4感染LMH细胞前后chcGAS细胞定位变化。结果表明,本试验克隆得到大小为1317 bp的chcGAS基因,与其他物种同源性为50.5%~84.4%,SDS-PAGE分析结果显示,chcGAS蛋白主要以可溶性蛋白质的形式在上清液处表达,目的蛋白质相对分子质量为75000,与预期大小相符。亚细胞定位结果显示,FAdV-4感染可导致定位于细胞核膜上的chcGAS蛋白转移到细胞质中。本研究结果为进一步研究FAdV-4与cGAS-STING信号通路的关联调控机制提供了科学依据。

ETT2转录因子EivF调控禽致病性大肠杆菌运动性和环境胁迫耐受性

为探究禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)中大肠杆菌Ⅲ型分泌系统(Escherichia coli TypeⅢsecretion system^(2),ETT2)转录因子EivF的功能,通过透射电镜观察检测野生株(AE81)、缺失株(AE81△eivF)和回复株(AE81△eivF-comp)Curli菌毛的合成能力,并探究3种菌株在不良环境中的存活情况,通过RT-qPCR检测鞭毛和环境耐受相关基因的转录水平。结果表明,与野生株相比,缺失株的curli菌毛合成能力无明显变化,在透射电镜下缺失株鞭毛数量明显减少,缺失株在强酸、强碱、氧化应激、高温、高渗环境中的存活率均显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)降低,回复株上述表型基本恢复。转录组数据显示,缺失株的flgB、flgC、flgE等鞭毛相关基因和proV、cadA等环境耐受相关基因的转录水平下调。RT-qPCR结果显示,flgB、flgC、flgE、proV等基因的转录水平下调。综上所述,ETT2转录因子EivF参与调控禽致病性大肠杆菌运动能力和在不良环境中的存活能力。

禽致病性大肠杆菌Hcp2b对雏鸡脾脏mRNA表达谱的影响

为研究效应蛋白Hcp2b在禽致病性大肠杆菌(APEC)感染雏鸡过程中对脾脏的转录组学影响,利用兽医病理生物学与疫病防控安徽省重点实验室构建保存的hcp2b基因缺失株Δhcp2b及回复株Chcp2b肌肉注射7日龄雏鸡(以AE17菌株为阳性对照),感染24 h后采集精神沉郁的雏鸡脾脏检测组织载菌量并制作病理切片。选取缺失株Δhcp2b及野生株AE17感染脾脏组织进行转录组学测序,采用Real-time PCR进行测序结果鉴定;而后对差异表达基因进行GO分析、KEGG通路富集分析。结果显示,野生株AE17、缺失株Δhcp2b及回复株Chcp2b在脾脏组织载菌量差异不明显。组织切片观察发现,野生株AE17和缺失株Δhcp2b脾脏均出现组织间隙扩大,有充血现象出现。转录组学分析发现,缺失株Δhcp2b感染雏鸡脾脏后,诱导了脾脏基因mRNA的差异表达,筛选到515个差异表达基因(330个基因下调表达,185个基因上调表达)。Real-time PCR结果发现,Δhcp2b感染雏鸡后,脾脏中IL22、TNFRSF6B、TNFRSF8基因mRNA表达量下调,与测序结果变化趋势一致。GO分析发现,感染24 h雏鸡脾脏差异基因富集在膜、膜的组成、细胞外间隙部分等条目。KEGG分析发现,脾脏差异基因显著富集在内质网蛋白质加工过程的信号通路中。hcp2b基因对APEC在定植脾脏无影响,hcp2b通过影响机体免疫器官中脾脏的内质网蛋白质加工过程的信号通路来参与致病过程。

犬肺表面活性蛋白A的克隆及其在昆虫杆状病毒系统的表达

利用RT-PCR方法扩增犬肺表面活性蛋白A(canine lung surfactant protein A,cSP-A)基因,将其连接至p MD18-T载体,经测序正确后,使用DNAMAN软件比对不同种属SP-A基因序列;将cSP-A基因片段经双酶切后连接至pFastbac1载体得到pFastbac1-cSP-A;再将其转化至DH10Bac感受态细胞,获得重组Bacmid质粒,然后转染sf9细胞得到P1代重组杆状病毒P1 rBv-cSP-A,P1代病毒连续扩增3代后,取P4 rBv-cSP-A感染sf9细胞表达cSP-A重组蛋白,利用蛋白免疫印迹和间接免疫荧光试验鉴定表达产物。结果显示cSP-A基因大小为699 bp;不同种属间SP-A的C末端碳水化合物识别结构域的同源性为49.1%~95.5%;经Western Blot和IFA鉴定,重组cSP-A蛋白在细胞内表达未分泌到胞外,分子量大小约为31.84 kDa。

基于16S rDNA测序的巢湖流域水体粪便污染溯源

排入地表水中的动物粪便会带来一系列生态与公共卫生问题,快速准确鉴别污染来源对于源头控制与污染治理具有重要意义。基于细菌群落的微生物溯源技术(Community-based microbial source tracking)以及高通量DNA测序技术(Nextgeneration sequencing,NGS),对污染源中微生物和环境样本中的微生物群落进行比较分析,进而对水体中粪便污染来源进行预测。本文利用16S rDNA测序,系统分析与比较了巢湖流域水体、沉积物样本与广泛的潜在污染源(包括村庄与养猪场污水,野生水鸟粪便,人类与家禽、家畜粪便)的细菌群落组成,同时,利用基于机器学习的溯源软件FEAST与Sourcetracker,对水体、沉积物样本的潜在污染源进行了预测。结果表明:水体与沉积物样本的微生物多样性显著高于粪便样本,其中巢湖水体与河流沉积物样本具有最高的物种多样性,同时样本中也存在大量未分类物种。变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria),拟杆菌门(Bacteroidetes)广泛分布于所有样本中。溯源分析结果表明,村庄排污口与污水处理厂排污口样本是河水样本最主要的污染来源,沉积物与湖水样本则预测存在猪场排污水与野生水鸟粪便的污染,所有样本未检测到来自人粪与鸡粪的污染。

鸡DDX 41基因克隆表达、细胞定位及其在禽腺病毒4型感染调控天然免疫中的作用

为获得鸡DDX41(chDDX41)的原核表达蛋白,探讨chDDX41的细胞定位及其在禽腺病毒4型(FAdV-4)感染引起的天然免疫中的作用。根据GenBank中chDDX41基因序列,设计特异性引物,以LMH细胞cDNA为模板扩增,将扩增序列连接至pET-32a、pCAGGS-HA、pCMV-3×Flag和pmCherry-C1空载体,构建重组质粒。将pET-32a-chDDX 41转化至大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导表达。利用激光共聚焦显微镜观察chDDX41在鸡肝癌细胞(LMH)和鸡巨噬细胞(HD11)中的亚细胞定位;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测在LMH细胞中过表达chDDX 41对IFN-β等细胞因子表达量的影响。结果表明,克隆得到1854 bp的chDDX 41基因,共编码617个氨基酸。SDS-PAGE结果显示,重组蛋白pET-32a-chDDX41主要以可溶性蛋白的方式在上清液中表达,经Western Blot鉴定,在90 ku左右有特异性条带,与预期结果一致;chDDX41在LMH和HD11细胞中主要定位在细胞核;FAdV-4感染过表达chDDX 41基因后的LMH细胞,发现IFN-β、IL-6、IL-1β和IL-8等细胞因子在mRNA水平上的表达量上调,表明chDDX41参与了FAdV-4引起的天然免疫应答。研究结果可为进一步研究DDX 41基因功能及其在天然免疫中的分子机制提供参考。

鸡粪堆肥中优势菌及复合固化菌剂载体的筛选

为了提高畜禽粪便堆肥降解效率和堆肥质量,比较不同堆肥时期微生物菌群结构和多样性。基于高通量测序分析堆肥前、中和腐熟时期样品的优势细菌,通过检测油脂、淀粉、纤维素、明胶分解性能和生理生化特性,筛选堆肥中的优势菌株,并优化优势菌株的培养条件和筛选最佳的菌剂载体。结果表明:芽孢杆菌是堆肥过程中的优势菌,成功筛选出具有堆肥微生态菌剂优势的3株芽孢杆菌,分别是D1解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、D5苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)和D7地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis);3株菌在环境温度为41℃时,pH为6.5~7.5,以酵母提取物为3株菌氮源时,酶活性最高,各菌同组产酶差异显著(P<0.05);以玉米芯粉为载体更能有效保护菌株活性。筛选优质高效的微生物和制备固体堆肥复合菌剂,有利于揭示堆肥过程中微生物作用的本质规律,为加速畜禽排泄物资源化提供有效途径。

血清4型禽腺病毒POCT荧光微球免疫层析检测方法的建立

为了迅速且便利地判定血清4型禽腺病毒(FAdV-4),设计引物进行扩增,构建重组载体,原核表达的融合蛋白乳化后动物免疫得到多克隆抗体,用Western Blot检测,最后建立即时检验(POCT)荧光微球免疫层析试纸条,并进行初步应用。用POCT荧光微球免疫层析试纸条检测不同浓度的FAdV-4病毒液及临床阳性样本,结果表明,用POCT荧光微球免疫层析试纸条15 min可以检测出结果,且检测出阳性,与临床诊断结果相符。建立的POCT荧光微球免疫层析检测FAdV-4的方法,特异性良好,操作简单且便于携带,检测效率高,有利于基层兽医临床检测。