罗阿丝虫病实验室诊断方法的研究进展

罗阿丝虫病是由罗阿丝虫引起的一种寄生虫病,主要流行于中非和西非。但随着国际交往的日渐频繁,罗阿丝虫病在非流行区越来越多见,我国近年来有散发输入性病例报告。准确的实验室诊断不但对罗阿丝虫病的早发现和早治疗至关重要,而且对其潜在传染源的早发现有重要意义。本文就罗阿丝虫病的实验室诊断方法进行综述,以期为临床实践提供参考。

2006～2010年安徽省疟疾流行时空分布特征

目的:分析2006～2010年安徽省疟疾流行的时空分布。方法:收集全国2006～2010年疟疾发病数据,对我国疟疾流行情况进行统计分析,并绘制全国疟疾发病地理分布图。对安徽省疟疾流行情况进行年发病和季节发病的统计分析。结果:2006～2010年安徽省疟疾累计发病83 553例,居全国首位,年均发病率27.32/10万。发病率从每年的5月份开始上升,6～10月达高峰,10月后开始下降。2006～2010年疟疾发病数在安徽省甲、乙类法定报告传染病总数的排名除2010年为第16位外,其余均为前10位;在自然疫源性及虫媒传染病报告总数的排名一直位居第一位。结论:2006～2010年安徽省疟疾发病呈逐年下降趋势,但仍居全国一、二位。疟疾是安徽省发病率最高的虫媒传染病,仍需加强防治工作。

疟疾实验室诊断方法的新进展

疟疾是经蚊媒传播的重要热带病，据WHO统计全球约有40％的人生活在疟疾流行区，每年有3～5亿人感染，110万人死于疟疾，尽管采取多种防治措施并取得了丰硕的成果，但当前疟疾仍然是热带与亚热带国家和地区危害公众健康、影响经济发展的主要因素之一。近年来，我国的疟疾感染形势仍然相当严峻，据统计2006年全国23个省917个县有疟疾病例报告，发病数较2005年上升51．7％，

减毒结核分枝杆菌H37Ra感染小鼠模型的实验研究

目的:研究减毒结核分枝杆菌(M.tb)H37Ra感染小鼠模型及其病理损伤的机制。方法:将清洁级Balb/c小鼠分为对照组和M.tb模型组,各3只。将H37Ra按照每只小鼠1×106CFU的剂量,经尾静脉注射感染小鼠,分别于感染7、14和21 d后,无菌操作取小鼠肺和脾脏组织,测量肺和脾脏的脏器系数,匀浆后行活菌培养;肺和脾脏组织冷冻切片,行HE染色观察病理损伤情况。结果:小鼠感染M.tb 14和21 d后,脾脏脏器系数均较感染7 d后显著升高(P<0.01和P<0.05)。感染7 d后,肺和脾脏组织匀浆均可检出活菌,脾脏组织H37Ra活菌量明显高于肺脏,并随感染时间逐渐增加;感染14 d后,肺组织病理观察可见明显感染性病变损伤。结论:M.tb H37Ra经尾静脉注射感染小鼠模型可造成部分结核病样病理性损伤。

蠕虫及其衍生产物治疗自身免疫性疾病的临床进展

自身免疫性疾病传统治疗自身免疫性疾病的药物会产生诸多不良反应,且目前治疗的方式多侧重于症状的控制而不是治愈,给人们造成了巨大的健康问题和经济负担。近年来,临床研究证明某些蠕虫及其衍生产物治疗自身免疫性疾病具有明显的治疗效果,而其作为一种近天然的免疫调节剂,作用相较于治疗自身免疫性疾病的广谱免疫抑制剂和皮质类固醇更加温和。但不同的蠕虫及其衍生产物治疗自身免疫性疾病的机制与效果也不尽相同。本文主要总结了蠕虫及其衍生产物治疗炎症性肠病、多发性硬化症和自闭症谱系障碍的临床进展,以提供新的临床治疗思路。

基于结核杆菌耐热抗原小分子多肽刺激人外周血T细胞产生TNF-α和IFN-γ鉴别肺结核和潜伏性结核感染

目的研究结核杆菌耐热抗原小分子多肽(Mtb-HAg-10k)刺激人外周血T细胞产生细胞因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和干扰素-γ(IFN-γ)的作用特点及肺结核患者和潜伏性感染者IFN-γ产生细胞的数量差异,初步探讨Mtb-HAg-10k作为诊断抗原鉴别肺结核和潜伏性结核感染的可行性。方法以超滤离心法获得的Mtb-HAg-10k为刺激剂作用于人外周血单个核细胞(PBMCs),并以Mtb-HAg、植物血凝素PHA作为对照,用多色流式细胞术检测T细胞亚群中TNF-α和IFN-γ产生细胞比例,酶联免疫斑点法检测肺结核患者和潜伏性感染者PBMCs中IFN-γ产生细胞数量。结果流式细胞术检测人外周血Mtb-HAg-10k特异性γδT细胞中TNF-α产生细胞比例显著高于IFN-γ产生细胞比例(P<0.01);与PHA刺激组相比,γδT细胞中TNF-α和IFN-γ产生细胞比例增高(P<0.01),而αβT细胞中TNF-α和IFN-γ产生细胞比例显著降低;酶联免疫斑点法检测Mtb-HAg-10k刺激的健康者PBMCs中IFN-γ产生细胞数量低于Mtb-HAg刺激组和PHA对照组(P<0.01);肺结核患者IFN-γ产生细胞数量低于潜伏性结核感染者(P<0.01)。结论以Mtb-HAg-10K为刺激剂可使人外周血γδT细胞优势产生TNF-α和IFN-γ,通过酶联免疫斑点法检测PBMCs中IFN-γ产生细胞数量差异有助于鉴别肺结核和潜伏性结核感染。

西咪替丁伍用弓形虫ROP2蛋白免疫小鼠诱导免疫反应的初步研究

目的观察西咪替丁伍用弓形虫棒状体蛋白2(ROP2)免疫小鼠诱导的免疫反应。方法 80只BALB/c小鼠随机分为A组、B组、C组和D组,各组分别经皮下注射PBS、弓形虫ROP2蛋白+PBS、弓形虫ROP2蛋白+福氏佐剂和弓形虫ROP2蛋白+西咪替丁[200 mg/(kg.d)]免疫BALB/c小鼠,每次ROP2蛋白免疫剂量为100μg/只(200μl),共免疫3次,每次间隔2周。于首次免疫前和每次免疫后2周,采血分离血清。末次免疫后2周,每组小鼠随机处死8只,无菌分离脾细胞,CCK-8法测定淋巴细胞增殖活性。流式细胞术检测小鼠全血T细胞亚群。ELISA法检测小鼠血清IgG抗体和γ干扰素(IFN-γ)水平。各组剩余12只小鼠经腹腔感染弓形虫RH株速殖子(5×104个/鼠),观察攻击感染后小鼠生存时间。结果末次免疫后2周,A、B、C和D组小鼠的血清IFN-γ水平分别为(659.750±239.962)、(872.750±197.011)、(1 600.750±480.680)和(1 494.375±451.655)pg/ml,血清特异性IgG抗体水平分别为0.504±0.078、0.592±0.160、1.068±0.111和1.046±0.147,脾细胞增殖活性分别为0.504±0.078、0.592±0.160、0.831±0.130和0.762±0.089,外周血CD4+/CD8+比值分别为0.504±0.078、0.592±0.160、0.831±0.130和0.762±0.089,C和D组均显著高于A和B组(前3个指标,均P<0.01;后者,均P<0.05),D组与C组的差异均无统计学意义(P>0.05)。各免疫组弓形虫攻击感染后,A、B、C和D组小鼠的生存时间中位数分别为96、108、132和132 h,C组和D组小鼠平均存活时间显著长于A组和B组(P<0.05),D组与C组的相比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论西咪替丁可增强ROP2蛋白诱导的细胞免疫和体液免疫反应。

猪带绦虫抗原刺激囊虫病患者PBMC Th1/Th2细胞因子的表达及其免疫调节

目的检测猪带绦虫不同虫期抗原刺激囊虫病患者外周血单个核细胞(PBMC)Th1/Th2细胞因子的表达水平,并分析其在囊虫病免疫调控中的作用。方法用流式细胞仪检测囊虫病患者新鲜血T淋巴细胞亚群,并以猪带绦虫六钩蚴抗原或囊尾蚴抗原刺激囊虫病患者PBMC,分别在刺激的第0d、5d、10d和15d时检测Th1/Th2细胞因子(IFN-γ及IL-4),对分泌IFN-γ或IL-4的不同细胞群体进行数据分析。结果囊虫病患者新鲜血T淋巴细胞亚群CD3+与CD4+细胞较正常人升高,CD4+/CD8+较正常人升高,分泌IFN-γ及IL-4的CD3+细胞百分率较正常人升高;猪囊尾蚴抗原刺激囊虫病患者PB-MC第0d、5d、10d和15d时,分泌IFN-γ的CD3+细胞百分率分别为25.42%±5.53%,30.46%±4.94%,36.52%±4.73%,38.69%±5.58%;分泌IL-4的CD3+细胞百分率分别为2.52%±0.52%,3.00%±0.57%,3.81%±0.70%,5.03%±0.73%。六钩蚴抗原刺激囊虫病患者PBMC分泌IFN-γ及IL-4的CD3+细胞百分率亦呈现相同的变化趋势。结论囊虫病患者与正常人相比PBMC中存在T淋巴细胞的极化水平异常,CD3+与CD4+细胞百分率均显著升高,T细胞亚群比例失调,免疫功能紊乱;随着囊尾蚴抗原刺激外周血PBMC时间延长,分泌IFN-γ和IL-4的CD3+细胞百分率逐渐升高。

重组日本血吸虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂对急性肝损伤小鼠的保护作用及机制

目的 探讨重组日本血吸虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂对LPS/D-GalN诱导的急性肝损伤小鼠的保护作用及机制。方法 将72只雄性C57BL/6J小鼠(6~8周龄)随机分为正常对照组、LPS/D-GaIN模型组、LPS/D-GaIN+rSj-Cys治疗组和rSj-Cys对照组(n=18)。LPS/D-GaIN组和LPS/D-GaIN+rSj-Cys组小鼠均腹腔注射LPS(10μg/kg)和D-GaIN(700 mg/kg)造模;造模后30 min,LPS/D-GaIN+rSj-Cys组及rSj-Cys对照组小鼠均腹腔注射rSj-Cys(1.25 mg/kg),正常对照组小鼠注射等体积PBS。造模6 h后,每组随机挑选8只小鼠处死,收集小鼠血清及肝组织,进行后续检测,每组剩余10只分别在3、6、12、24 h观察其生存情况,并计算生存率。检测血清丙氨酸转移酶(ALT)、天冬氨酸转移酶(AST)水平,苏木精-伊红(HE)染色观察各组小鼠肝脏组织病理形态,采用ELISA检测小鼠血清炎性因子肿瘤坏死因子(TNF-α)和白细胞介素(IL-6)表达,采用免疫组化法检测肝组织巨噬细胞表面标记物CD68表达水平,采用免疫组化和免疫印迹法检测肝组织Bax、Bcl-2蛋白水平,采用TUNEL检测肝细胞凋亡情况,采用免疫印迹法检测肝组织内质网应激相关蛋白表达水平。结果 模型组小鼠12 h生存率为30%,rSj-Cys治疗组小鼠12 h生存率为80%。模型组小鼠24 h生存率为10%,rSj-Cys治疗组小鼠24 h生存率为60%;与正常对照组相比,LPS/D-GaIN模型组小鼠血清中AST、ALT、IL-6、TNF-α含量均显著上升(P<0.01),病理结构损伤严重,肝脏巨噬细胞标志物CD68表达明显增强(P<0.01),促凋亡蛋白Bax表达显著增加(P<0.01),抗凋亡蛋白Bcl-2表达显著降低(P<0.01),肝细胞凋亡水平显著增加,肝组织内质网应激相关信号通路GRP78、CHOP、NF-κB p-p65的蛋白表达水平显著上调(P<0.05或P<0.01);而LPS/D-GaIN+rSj-Cys治疗组小鼠转氨酶AST、ALT和炎症因子IL-6、TNF-α水平显著下降(P<0.01),肝脏病理损伤程度减轻,肝脏巨噬细胞标志物CD68表达明显降低(P<0.01),Bax表达显著降低(P<0.01),Bcl-2表达显著增强(P<0.01),肝组织内质网应激相关信号通路GRP78、CHOP、NF-κB p-p65的蛋白表达水平下调(P<0.05或P<0.01);rSj-Cys对照组与正常对照组相比,各指标无统计学差异(P>0.05)。结论 rSj-Cys通过抑制内质网应激,减轻炎症和肝细胞凋亡缓解LPS/D-GalN引起的小鼠急性肝损伤。

乙醛脱氢酶1在胃癌组织中的表达及与幽门螺杆菌L型感染的关系

目的探讨乙醛脱氢酶1(ALDH1)在人胃癌组织中的表达与幽门螺杆菌L型(Hp-L型)感染的关系。方法应用免疫组化Elivision法和原位杂交方法检测126例胃癌及30例正常对照胃组织ALDH1的表达,应用革兰染色和免疫组化法检测上述组织的Hp-L型感染情况。结果胃癌组织中ALDH1蛋白和mRNA的表达阳性率分别为53.2%和56.3%,与对照组之间差异具有统计学意义(均P<0.01),ALDH1蛋白的表达与肿瘤的临床TNM分期和淋巴结转移密切相关(均P<0.01)。胃癌及对照组中Hp-L型的阳性率分别为67.5%和23.3%,差异具有统计学意义(P<0.01)。胃癌组Hp-L型感染阳性者的ALDH1蛋白表达阳性率高于Hp-L型感染阴性组(P<0.05)。ALDH1蛋白的表达与Hp-L型感染呈正相关(rs=0.220,P<0.05)。ALDH1阳性患者5年生存率明显低于ALDH1阴性患者(P<0.05)。结论 ALDH1在胃癌组织中高表达,可作为评价胃癌预后的指标,Hp-L型感染可促进其表达。

结核病DNA疫苗pVAX1/ESAT-6的构建、鉴定及免疫效应评价

目的构建结核病DNA疫苗pVAX1/ESAT-6并探讨其诱导的免疫效应。方法将扩增自结核杆菌基因组的ESAT-6基因装入pVAX1载体构建pVAX1/ESAT-6重组质粒;经酶切、测序鉴定后,利用阳离子聚合物介导将重组质粒pVAX1/ESAT-6转染Hela细胞,分别以RT-PCR法检测ESAT-6 mRNA的表达、间接免疫荧光法检测ESAT-6蛋白表达。重组质粒经体内电转染免疫小鼠后,采用ELISA法测定小鼠血清中IFN-γ及抗ESAT-6特异性抗体IgG的水平;流式细胞术检测小鼠淋巴细胞增殖水平;ELISPOT检测产生IFN-γ的淋巴细胞频数。结果构建的重组质粒pVAX1/ESAT-6经双酶切于3000 bp和300 bp处各见1条带,测序结果显示插入序列与ESAT-6基因序列无差异。重组质粒转染Hela细胞后,RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳于约300 bp处见目的条带,间接免疫荧光检测显示特异性绿色荧光。重组质粒免疫小鼠后,血清中抗ESAT-6特异性抗体IgG水平较对照组(空质粒组和生理盐水对照组)明显升高;血清中IFN-γ水平、小鼠脾淋巴细胞增殖水平及产生IFN-γ的淋巴细胞数明显均高于对照组(空质粒组和生理盐水对照组)。结论成功构建了结核病DNA疫苗pVAX1/ESAT-6,该疫苗可有效诱导小鼠产生特异性细胞免疫和体液免疫效应。

猪囊尾蚴病患者IFN-γ、IL-4的免疫组织化学研究

目的观察猪囊尾蚴病患者局部病灶的病理学特征及IFN-γ/IL-4表达情况,探讨IFN-γ/IL-4在免疫调控中的作用及意义。方法对病变组织进行苏木素伊红(HE)染色观察炎性细胞浸润情况;并用链霉菌抗生物素蛋白—过氧化酶(SP)免疫组织化学方法观察其IFN-γ/IL-4的表达水平。结果45例病变组织中35例有IFN-γ的表达,阳性表达率为77.78%,24例有IL-4的表达,阳性表达率为53.33%,阳性表达多定位于异物巨细胞、淋巴细胞和巨噬细胞的胞浆;脑型囊尾蚴病IL-4的阳性表达强度高于皮肌型。结论猪囊尾蚴感染的病变组织中有多种类型炎细胞浸润,以异物巨细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞浸润为主;炎细胞中IFN-γ表达较普遍,同时也有IL-4的表达。

胃癌中幽门螺杆菌L型感染和淋巴管生成因子与淋巴结转移的关系

目的研究胃癌组织中血管内皮生长因子-C、-D、-A(VEGF-C、-D、-A)及成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)的表达和幽门螺杆菌L型(helicobacter pylori L-form,Hp-L型)感染与淋巴结转移的关系。方法应用革兰染色和免疫组化SP法检测112例胃癌组织和30例对照组中的Hp-L型感染情况,同时免疫组化SP法检测上述组织中VEGF-C、-D、-A及FGF-2的表达情况及D2-40标记的微淋巴管密度值(LVD值),分析Hp-L型和淋巴管生成因子表达的关系及与LVD值的关系。结果胃癌组织中革兰染色Hp-L型检出率为65%,免疫组化Hp-L型抗原表达率为62%。胃癌组的Hp-L型阳性率、淋巴管生成因子阳性率及LVD值均高于对照组(均P<0.01);胃癌组中Hp-L阳性组的LVD值和VEGF-C、-D的表达阳性率均高于Hp-L阴性组(均P<0.05);VEGF-C、-D阳性组的LVD值高于阴性组(均P<0.05)。多因素分析发现,TNM分期和LVD值与胃癌淋巴结转移密切相关(均P<0.05)。结论 Hp-L型感染和淋巴管生成因子与胃癌的发生、发展相关,VEGF-C、-D与胃癌淋巴管生成关系密切,Hp-L型感染在肿瘤淋巴管生成和淋巴结转移方面具有一定作用,两方面因素共同促进胃癌的侵袭和转移。

以VEGF、MMP-2检测验证幽门螺杆菌L型感染与胃癌的关系

目的研究幽门螺杆菌L型(Helicobacter pyloriL-form,Hp-L型)感染对胃癌的发生、发展和侵袭、转移等生物学行为的影响,并探讨其机制。方法应用革兰染色和免疫组化SP法检测130例胃癌和50例对照组的Hp-L型感染,应用免疫组化SP法检测上述组织的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、基质金属蛋白酶-2(matrixmet-alloproteinase-2,MMP-2)蛋白的表达。结果130例胃癌中免疫组化及革兰染色同时Hp-L型阳性的病例有88例。胃癌组与对照组的Hp-L型阳性率相比具有统计学意义(67.69%vs24%,P<0.05)。胃癌组中Hp-L型阳性组的MMP-2、VEGF表达阳性率高于其Hp-L型阴性组(P<0.05);胃癌组中Hp-L型阳性MMP-2和VEGF的表达阳性呈正相关(r=0.45,r=0.30,P<0.001)。结论Hp-L型感染是影响胃癌侵袭和转移的重要因素之一。其机制与胃癌细胞的VEGF、MMP-2的表达上调有关。

COX-2选择性抑制剂塞来昔布联合PPAR-γ配体罗格列酮治疗子宫内膜癌的实验研究

目的研究环氧合酶-2(COX-2)和过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)蛋白在子宫内膜癌中的表达和临床意义,探讨COX-2选择性抑制剂塞来昔布联合PPAR-γ配体罗格列酮共同应用对于肿瘤细胞的干预效果。方法采用免疫组化方法,结合组织芯片技术,检测124例子宫内膜样腺癌、35例正常子宫内膜中COX-2和PPAR-γ蛋白的表达水平,结合临床病理因素进行分析。联合应用塞来昔布和罗格列酮处理RL95-2子宫内膜癌细胞,观察其对于肿瘤细胞生物学行为的影响和协同抑瘤作用。结果在子宫内膜样腺癌中,COX-2蛋白表达明显升高,PPAR-γ蛋白表达相对降低,两者具有负性相关关系。塞来昔布和罗格列酮可以有效抑制RL95-2子宫内膜癌细胞的增殖、侵袭、转移能力,联合应用抑制肿瘤的效果明显高于单独药物组。结论 COX-2的高表达和PPAR-γ的低表达与子宫内膜癌的发生、发展有密切关系,以COX-2和PPAR-γ为共同靶点,有望成为临床子宫内膜癌预防和治疗的重要手段和有效途径。

蚌埠市某高校大学生面部蠕形螨感染情况调查

目的:调查蚌埠市某高校大学生面部蠕形螨感染情况,探讨影响蠕形螨感染因素。方法:随机抽取某高校临床医学专业5个年级的学生,共645名。采用改良透明胶纸法,在学生鼻翼、额头部采样,并以问卷形式对年龄、生活习惯、饮食习惯、皮肤状况、心理等进行调查。结果:大学生面部蠕形螨感染率为21.78%(132/606),多为轻度感染,占82.58%(109/132)。男、女生的蠕形螨感染率差异无统计学意义(P>0.05);5个年级学生的蠕形螨感染率差异有统计学意义(P<0.05)。不同年龄、饮食习惯、皮肤类型学生的蠕形螨感染率差异均无统计学意义(P>0.05);来自城市、良好卫生习惯者蠕形螨感染率明显较低(P<0.01);不同睡姿学生的蠕形螨感染率差异有统计学意义(P<0.01);面部皮肤损伤者蠕形螨感染率高于无皮肤损伤者(P<0.05)。多因素logistic回归分析显示,卫生习惯和面部皮肤损伤均是蠕形螨感染的影响因素(P<0.01)。76.40%(463/606)的学生认为皮肤和容貌对自信心、社会交往乃至求职会有一定影响。结论:蚌埠市某高校大学生面部蠕形螨感染率相对较低,面部蠕形螨的感染与卫生习惯和皮肤损伤密切相关,防治蠕形螨亦需重视学生心理健康。

三种免疫调节剂增强弓形虫重组ROP2疫苗保护效应的研究

目的观察弗氏佐剂(Freund’s Adjuvant,FA)、匹多莫德(Pidotimod,PT)和西咪替丁(Cimetidine,CIM)等3种免疫调节剂增强重组弓形虫棒状体蛋白2(rROP2)疫苗的免疫保护效应。方法将100只BALB/c小鼠随机分为PBS对照组、重组rROP2疫苗组、FA-rROP2疫苗组、PT-rROP2疫苗组和CIM-rROP2疫苗组等5组;FA、PT和CIM分别与rROP2抗原混合皮下注射免疫,检测小鼠细胞免疫和体液免疫指标,并观察弓形虫RH株攻击感染后的生存时间。结果 FA-rROP2组、CIM-rROP2组小鼠血清IFN-γ、特异性IgG、脾细胞增殖活性及外周血CD4+/CD8+比值均显著高于rROP2蛋白组(P<0.05);PT对外周血CD4+/CD8+比值无明显影响,但显著增加了IFN-γ的水平及脾细胞增殖活性。小鼠攻击试验表明,FA-rROP2组、PT-rROP2组以及CIM-rROP2组小鼠存活时间显著长于rROP2组和PBS对照组组;rROP2蛋白组各项指标均显著高于PBS组(P<0.05)。结论 FA、PT和CIM可增强rROP2蛋白抗原诱导的细胞免疫和体液免疫反应,都能延长攻击感染小鼠的生存时间,具有增强rROP2蛋白疫苗保护效应的功能。其中CIM的佐剂样免疫促进作用接近于FA,但副作用显著低于后者,具有临床实用的潜在价值。

外源性一氧化氮体外杀伤红内期间日疟原虫的实验研究

目的探讨外源性一氧化氮(NO)对红内期间日疟原虫的杀伤作用。方法采集以早期滋养体期为主,原虫密度>0.5%的患者血样,配成含2%红细胞的虫血混悬液。96孔板中每孔加100μl虫血混悬液,再加入各组试剂,亚硝基铁氰化钠(SNP,分别为0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00mmol/L),SNP+血红蛋白(Hb)0.15mmol/L,SNP+硫酸亚铁(FeSO4)0.15mmol/L,SNP+L-半胱氨酸(L-cyst)1.00mmol/L,SNP+FeSO40.15mmol/L+L-cyst1.00mmol/L,后4组SNP浓度均为1.00mmol/L,设对照组,每组重复3次,置37℃5%CO2培养箱中培养。根据虫龄,估计发育至裂殖体时间,提前3h取空白对照孔涂片镜检,确定终止培养时间,培养终止后吉氏染色,镜检计数成熟裂殖体,计算NO对红内期间日疟原虫的抑制率,统计分析各组对间日疟原虫抑制率的差异。结果SNP0.02mmol/L组,间日疟原虫抑制率为(0.84±1.69)%,对培养的红内期间日疟原虫无杀伤作用(P>0.05);SNP0.05mmol/L组,间日疟原虫抑制率为(12.26±3.04)%,对培养的红内期间日疟原虫存在杀伤作用(P<0.01)。且抑制率随SNP浓度上升而升高。在含有1.00mmol/LSNP的孔中分别加入Hb、L-cyst、FeSO4和FeSO4+L-cyst与只添加SNP1.00mmol/L孔相比,红内期间日疟原虫抑制率自(85.40±2.90)%下降为(5.90±2.90)%、(25.86±4.02)%、(30.16±2.75)%和(16.71±2.30)%。结论外源性NO对体外培养的红内期间日疟原虫有杀伤作用,而Hb、L-cyst和FeSO4可以逆转这种杀伤作用。

抗疟原虫单抗M26-32 IgM的单体化及其免疫学特性研究

目的改造IgM类抗疟原虫单抗M26-32为单体IgM亚单位,胶体金标记天然和改造后两种M26-32用于检测疟原虫抗原。方法复苏培养M26-32杂交瘤细胞,接种BALB/c小鼠,收集含有单抗的腹水,用商品HiTrap IgM HP柱纯化腹水中的IgM抗体,并用L-半胱氨酸裂解IgM类M26-32单抗成单体IgM亚单位。经间接免疫荧光检定两种抗体的效价,并用胶体金标记,分别检测恶性疟原虫和间日疟原虫可溶性抗原。结果接种20只小鼠,共采集约80mL单抗腹水,经HiTrap IgM HP柱纯化,获得了纯度较高的M26-32单抗。经L-半胱氨酸裂解后,Native电泳显示天然IgM被裂解为单体亚单位,IFA结果显示,亚单位M26-32与天然五聚体IgM滴度无差别。经胶体金标记后,两种金标抗体均分别能检测1∶100稀释的恶性疟原虫和1∶10稀释的间日疟原虫可溶性抗原。结论建立了L-半胱氨酸裂解IgM类M26-32单抗为单体IgM亚单位及其胶体金标记的方法,为利用M26-32进一步制备相应快速诊断工具奠定基础。

刚地弓形虫缓殖子期特异抗原BSR4的重组表达与免疫特性的初步研究

目的重组表达刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)Prugniaud(PRU)株缓殖子期特异抗原(BSR4)基因,并检测其免疫特性。方法将已构建的重组表达质粒pET28a(+)-BSR4转化至大肠埃希菌(E.coli)BL21中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达并纯化。分别以慢性感染PRU株刚地弓形虫小鼠血清和健康小鼠血清为一抗,用蛋白质印迹(Western blottting)鉴定BSR4重组蛋白的免疫反应性。用3H-TdR掺入法检测慢性感染PRU株刚地弓形虫小鼠脾淋巴细胞对不同浓度BSR4重组蛋白的特异性增殖水平,计算刺激指数(SI)。以BSR4重组蛋白为抗原,用ELISA法检测急性(抗弓形虫IgG-IgM+)和慢性(抗弓形虫IgG+IgM-)弓形虫病患者血清,以及健康人血清,各20份,评判该蛋白的免疫反应性。结果重组质粒pET28a(+)-BSR4经IPTG诱导后表达重组蛋白BSR4,经变性、复性和纯化后获得相对分子质量(Mr)45 000的可溶性蛋白。Western blotting分析结果显示,该蛋白能被慢性弓形虫感染小鼠血清识别。脾淋巴细胞增殖试验表明,1、5和25μg/ml重组蛋白BSR4刺激感染弓形虫小鼠脾淋巴细胞的SI分别为1.13、0.88和1.17,显著高于未感染组(分别为0.46、0.24和0.49,均P<0.01)。ELISA检测结果显示,BSR4抗原能被慢性弓形虫病患者血清(IgG+IgM-)特异性识别(20/20),而不能被急性弓形虫病患者血清(IgG-IgM+)识别(0/20)。结论重组BSR4蛋白具有特异的免疫原性和免疫反应性。