siRNA靶向EDAG-1基因对K562细胞株生长的影响

背景与目的:胚胎发育相关基因-1(EDAG-1)是造血系统发育相关的新基因,定位于9q22。本研究探讨抑制EDAG-1基因的表达对白血病细胞株生长的影响及其机制。方法:将靶向EDAG-1基因的特异序列连接到逆转录病毒载体中,脂质体介导的重组质粒转染包装病毒细胞(PT67),收集细胞上清感染K562细胞株,经嘌呤霉素筛选稳定抑制EDAG-1基因表达的细胞株,RT-PCR检测EDAG-1基因的抑制情况,应用MTT、流式细胞仪检测转染细胞的增殖能力及细胞周期。结果:成功构建了靶向EDAG-1基因的逆转录病毒重组质粒,建立了抑制EDAG-1基因表达的K562细胞株。抑制EDAG-1基因表达的细胞株增殖速度、增殖指数(PI)、增殖活性(SPF)相应降低,其G0/G1期细胞比例明显升高。结论:EDAG-1基因的沉默可以抑制白血病细胞株的增殖,使其阻滞在G0/G1期,提示EDAG-1基因可能是白血病治疗的一个有效靶点。

RACE策略扩增EDAG-1基因3′端及序列分析

目的通过RACE(rapid amplification of cDNA Ends)技术分析K-562细胞株中高表达的EDAG-1基因3′端。方法采用Marathon-ReadyTMcDNA方法扩增HLCM cDNA(人白血病细胞株K-562,Marathon-ReadyTMcDNA)的EDAG-1基因3′端,将扩增的特异带回收纯化,构建到原核表达载体中,提取质粒并且测序分析。结果第1次扩增、第1次巢式PCR扩增未见明显特异带,2次巢式PCR结果可见200bp特异带,回收后连接到pMD18-T中,转化到大肠杆菌中并筛选阳性菌落,提取质粒测序,结果未发现该段序列存在点突变、插入或缺失。结论EDAG-1基因在白血病细胞株K-562中高表达的机制可能与3′端无关。