GSDMB调控肠上皮细胞命运的分子机制初探

目的初步探讨Gasdermin B(GSDMB)调控肠上皮细胞命运的分子机制。方法过表达人GSDMB质粒到两种人肠上皮细胞系(NCM460和HT-29细胞)和人结肠类器官中,采用免疫印迹法(Western blotting)检测电转效率,并利用细胞计数试剂盒(CCK8),流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期以分析GSDMB过表达对细胞功能的影响。转录组测序分析GSDMB的下游效应分子。组间数据比较采用t检验。结果成功重构两种肠上皮细胞系GSDMB蛋白过表达,过表达GSDMB蛋白的人肠上皮细胞吸光度值(A)[NCM460细胞:(1.17±0.01);HT-29细胞:(0.96±0.06)]明显低于空白对照组[NCM460细胞:(1.67±0.12);HT-29细胞:(1.24±0.07)],差异有统计学意义(t=7.24、5.46,P<0.05);GSDMB过表达组细胞凋亡数目[NCM460细胞:(12.03±1.55);HT-29细胞:(29.30±4.48)]显著多于空白对照组[NCM460细胞:(4.96±1.74);HT-29细胞:(6.95±3.42)],差异有统计学意义(t=5.26、6.97,P<0.05);细胞周期分析显示,GSDMB过表达组细胞G0/G1期比例[NCM460细胞:(47.98±5.28)%;HT-29细胞:(38.04±3.45)%]明显低于空白对照组[NCM460细胞:(59.54±3.90)%;HT-29细胞:(63.81±1.76)%],差异有统计学意义(t=3.05、11.53,P<0.05)。转录组测序结果发现,双特异性磷酸酶4和6(DUSP4和DUSP6)基因在肠上皮细胞表达GSDMB蛋白后显著上调,荧光定量PCR结果证实肠上皮细胞转染GSDMB后DUSP4(2.45±0.15)和DUSP6(4.34±0.22)相对表达水平显著高于对照组(1.06±0.05和1.01±0.02),差异有统计学意义(t=15.08、26.52,P<0.05)。使用DUSP抑制剂BCI处理重构GSDMB表达的NCM460细胞,发现BCI处理组p-ERK表达水平相对于对照组显著升高[(1.14±0.17)vs.(0.58±0.12)],差异有统计学意义(t=5.42,P=0.002),且BCI处理组细胞A值(1.84±0.07)和G0/G1期比例(59.83±2.17)%高于未处理组[(1.52±0.10)和(52.10±2.23)%],BCI处理组细胞凋亡数目(7.60±0.56)明显少于未处理组(12.57±1.00),差异均有统计学意义(t=4.71、4.31、7.52,P<0.05)。过表达GSDMB后的人结肠类器官TUNEL染色提示凋亡的细胞明显增多,DUSP6蛋白相对表达水平(0.85±0.09)显著高于对照组(0.21±0.04),同时伴随p-ERK水平的下降[(0.83±0.18)vs.(0.19±0.06)],差异有统计学意义(t=11.95,P<0.001;t=6.56,P<0.001)。结论GSDMB可能通过调节DUSP6介导的ERK信号来抑制细胞增殖,诱导细胞周期阻滞,促进细胞凋亡,从而影响肠上皮细胞命运。

外周血中CD4^-CD8^-T细胞的分离及生物学特性检测

目的分离和培养外周血中CD4-CD8-T细胞,检测其生物学活性。方法应用免疫磁珠法分离CD4-CD8-T细胞,流式细胞仪检测CD4-CD8-T细胞纯度,ELISA法检测CD4-CD8-T细胞分泌的IL-4、IFN-γ含量。结果CD4-CD8-T细胞分离后纯度为82.77%,CD4-CD8-T细胞分泌IFN-γ的量为(159.28±38.16)pg/ml,而IL-4含量未能检测出。结论CD4-CD8-T细胞可分泌IFN-γ,基本不分泌IL-4。

TFPI-2对胰腺癌细胞体内和体外侵袭能力的影响

目的研究组织因子途径抑制物-2(TFPI-2)基因对人胰腺癌细胞系Panc-1细胞侵袭能力的影响。方法通过脂质体法将TFPI-2基因转染到Panc-1细胞,用RT-PCR和Western blot分别检测转染前、后TFPI-2mRNA和相应蛋白的表达。Boyden小室法测定Panc-1-TFPI-2、Panc-1-V和Panc-1-P3组细胞的体外侵袭能力的变化,同时将3组细胞分别接种裸鼠,观察其体内肿瘤生长及转移情况。结果转染成功的Panc-1细胞有TFPI-2mRNA及相应蛋白的表达;Panc-1-TFPI-2组、Panc-1-V组和Panc-1-P组细胞穿膜细胞数分别为(24.4±3.5)个、(61.3±4.1)个和(60.2±3.9)个,前者明显少于后两者(P<0.05),提示Panc-1-TFPI-2组细胞的体外侵袭能力下降。3组细胞分别接种裸鼠,Panc-1-TFPI-2组肿瘤体积为(438.0±69.8)mm3,与Panc-1-V组的(852.0±102.9)mm3和Panc-1-P组的(831.0±78.1)mm3相比明显缩小,差异有统计学意义(P<0.05);镜下见Panc-1-V组和Panc-1-P组肿瘤组织浸润到肌层,有肝、肺转移灶,而Panc-1-TFPI-2组未见肌层浸润及肝、肺转移。结论TFPI-2基因表达可抑制胰腺癌细胞系Panc-1的侵袭转移能力,为胰腺癌的基因治疗提供了实验依据。

奥曲肽抑制转化生长因子α诱导肝癌细胞增殖的实验研究

目的探讨奥曲肽对转化生长因子α(TGF-α)诱导肝癌细胞增殖的抑制作用及其机制。方法用免疫组化法观察奥曲肽对TGF-α诱导肝癌细胞增殖的影响,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测奥曲肽对肝癌细胞TGF-α分泌和表皮生长因子受体(EGFR)表达的影响,用Western-blot法、免疫组化法检测奥曲肽对细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)的影响。结果奥曲肽明显抑制细胞核内TGF-α诱导的增殖细胞核抗原(PCNA)表达,使肝癌细胞TGF-αmRNA指数较对照组降低(P<0.05),对TGF-α诱导的EGFRmRNA指数的增加具有明显抑制作用。Western-blot显示,奥曲肽明显抑制TGF-α诱导的ERK蛋白表达;免疫组化显示,TGF-α作用后,胞核染色明显加深,奥曲肽与TGF-α同时作用后胞核染色明显减弱。结论奥曲肽可能通过抑制肝癌细胞分泌TGF-α,抑制EGFR表达和阻断EGFR信号传导,从而抑制TGF-α诱导的肝癌细胞增殖。

胰腺癌TFPI-2蛋白表达与细胞凋亡

目的:探讨胰腺癌组织中细胞凋亡与TFPI-2基因表达的相互关系,研究TFPI-2对胰腺癌细胞凋亡的影响。方法:应用免疫组化技术检测TFPI-2基因在50例胰腺癌及9例正常胰腺组织中的表达,并应用TUNEL法检测细胞凋亡,计算凋亡指数;体外将TFPI-2基因真核表达载体转染人胰腺癌细胞株Panc-1细胞,DNA片段化实验检测细胞凋亡。结果:TFPI-2在胰腺癌中的表达低于正常胰腺组织,TFPI-2指数分别为73.28±9.63和81.42±12.25,P<0.05,差异有统计学意义。TFPI-2的表达及细胞凋亡与临床分期及转移有关,Ⅰ、Ⅱ期及无转移的胰腺癌组织中TFPI-2指数及AI值均高于Ⅲ、Ⅳ期及有转移的胰腺癌组织,TFPI-2阳性组织中的AI值高于TFPI-2阴性组织的AI值,P<0.05,差异有统计学意义;DNA片段化实验证实TFPI-2能诱导Panc-1细胞凋亡。结论:胰腺癌组织中细胞凋亡与TFPI-2的表达水平有关,TFPI-2可能在诱导胰腺癌细胞凋亡中起重要作用。

TFPI-2基因克隆及其在胰腺癌细胞中的表达

目的克隆人TFPI-2基因全长cDNA,构建其真核表达载体,并将其转染到人胰腺癌细胞Panc-1中,检测其表达。方法用RT-PCR法从人胎盘组织中扩增人TFPI-2基因,并将其与真核表达载体pEGFP-C1连接,构建真核表达载体pEGFP-C1-TFPI-2。将构建的重组载体转染到人胰腺癌细胞系Panc-1细胞,Western blot检测TFPI-2在Panc-1细胞中的表达。结果RT-PCR成功的扩增出一条约708bp的片断,扩增片断与载体连接后,经限制性内切酶酶切电泳分析和DNA序列测定证实该基因已经成功构建到载体上,转染Panc-1细胞后,荧光显微镜观察到稳定转染细胞发出较强绿色荧光,Western blot技术证明TFPI-2基因能在Panc-1细胞中稳定表达。结论成功构建了人TFPI-2基因的真核表达载体pEGFP-C1-TFPI-2,获得了稳定表达TFPI-2的Panc-1细胞,证实TFPI-2基因能够在人胰腺癌细胞系Panc-1中高效、稳定的表达,为进一步研究其胰腺癌迁移、浸润及转移中的作用打下基础。

TFPI-2与VEGF在胰腺癌中的表达

目的:探讨胰腺癌中TFPI-2表达对胰腺癌肿瘤血管生成的影响。方法:采用免疫组织化学方法检测41例胰腺癌组织中TFPI-2、VEGF的表达及CD34单克隆抗体标记的微血管密度(MVD)。结果:Ⅰ、Ⅱ期胰腺癌及无远处转移的胰腺癌组织中TFPI-2阳性表达率分别为65.4%和57.1%,Ⅲ、Ⅳ期及有远处转移的胰腺癌组织中的TFPI-2阳性表达率分别为13.3%和23.1%,TFPI-2表达率,Ⅰ、Ⅱ期高于Ⅲ、Ⅳ期,无远处转移高于有远处转移,差异有统计学意义(P<0.05);VEGF阳性表达率在Ⅰ、Ⅱ期及无远处转移的胰腺癌组织分别为23.0%和32.1%,在Ⅲ、Ⅳ期及有远处转移的胰腺癌组织分别为66.7%和61.5%,两者比较,差异有统计学意义(P<0.05);Ⅲ、Ⅳ期及有远处转移的胰腺癌组织MVD值分别为28.47±2.23和19.00±2.58,高于Ⅰ、Ⅱ期的26.92±1.06及无远处转移的16.68±1.79,差异有统计学意义(P<0.05);胰腺癌组织中的TFPI-2的表达与VEGF的表达呈负相关(r=-0.54),差异有统计学意义(P<0.05);MVD与TFPI-2表达有关,TFPI-2阳性表达的胰腺癌组织MVD值为33.33±3.23,低于TFPI-2阴性表达的胰腺癌组织36.00±3.17,两者比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:胰腺癌中TFPI-2可能通过下调VEGF的表达抑制肿瘤新生血管的形成,从而抑制胰腺癌的生长、转移。

TFPI-2对胰腺癌细胞增殖及血管新生的抑制作用

目的探讨胰腺癌中组织因子途径抑制物-2(TFPI-2)的表达及作用。方法采用免疫组织化学方法检测41例胰腺癌组织中TFPI-2,Ki-67和VEGF的表达及CD34单克隆抗体标记的微血管密度(MVD)。结果Ⅰ,Ⅱ期胰腺癌TFPI-2阳性表达率(17/26)高于Ⅲ,Ⅳ期(2/15),高分化癌(12/19)高于中、低分化(7/22)(均P<0.05);Ⅰ,Ⅱ期癌细胞增殖指数(PI)(24.45±6.19)低于Ⅲ,Ⅳ期癌(30.84±6.70),高分化癌(24.42±6.29)低于中、低分化癌(28.84±7.12),(均为P<0.05);Ⅰ,Ⅱ期癌VEGF的阳性表达率(16/26)低于Ⅲ,Ⅳ期癌(14/15),高分化癌(11/19)低于中、低分化癌(19/22)(均P<0.05);Ⅰ,Ⅱ期癌MVD值(26.92±1.06)低于Ⅲ,Ⅳ期癌(28.47±2.23),高分化癌(19.00±2.58)低于中、低分化癌(16.68±1.79)(均P<0.05)。胰腺癌组织中TFPI-2的表达与Ki-67和VEGF的表达呈负相关(r=-0.62,P<0.05;r=-0.54,P<0.05),MVD与TFPI-2表达亦有相关。结论TFPI-2表达能够抑制胰腺癌细胞增殖,并通过下调VEGF的表达抑制肿瘤新生血管的形成,这可能是其抑制胰腺癌的生长、转移的重要机制。

结肠癌CME切除术与传统根治术的应用效果比较

目的比较临床结肠癌治疗中完整结肠系膜切除(complete mesocolon excision,CEM)术与传统根治术的应用效果。方法回顾性分析作者医院普通外科2009-03/2013-01收治的50例结肠癌患者的临床资料。结果 CME组患者的淋巴结清扫数量明显比传统手术组多,并发症发生率和复发率均明显比传统手术组低,差异具有统计学意义(P<0.05);输血量明显比传统手术组少,中位排气时间明显比传统手术组短,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论临床结肠癌治疗中CME切除术较传统根治术具有较好的应用效果,值得推广。

TFPI-2基因在调控胰腺癌细胞凋亡中的作用

背景与目的：组织因子途径抑制物2（tissue factor pathway inhibitor 2,TFPI-2）是新近发现的一种丝氨酸蛋白酶抑制物,与多种肿瘤发生发展有关。本实验研究将外源性TFPI-2基因转入对胰腺癌细胞株Panc-1观察TFPI-2对该细胞细胞增殖及凋亡的影响。方法：TFPI-2基因真核表达载体、空载体分别转染Panc-1细胞,并命名为Panc-1-TFPI-2,Panc-1-V细胞与未转染的对照细胞Panc-1分别测定细胞生长曲线,DNA片段化实验检测细胞凋亡,并用流式细胞仪分析3组细胞的细胞增殖、细胞周期情况。结果：Panc-1-TFPI-2细胞同Panc-1-V和Panc-1细胞相比,细胞生长缓慢,细胞生长受到抑制,被阻滞于G0-G1期;DNA片段化实验显示Panc-1-TFPI-2细胞呈现凋亡细胞特有的“梯状”条带,而Panc-1-V和Panc-1细胞无明显“梯状”条带;流式细胞仪分析显示早期Panc-1-TFPI-2细胞凋亡率（6.9±0.5）%较Panc-1-V和Panc-1细胞凋亡率[（3.0±0.4）%,（3.5±0.4）%]增加（P〈0.05）,统计学差异有显著性。结论：外源性TFPI-2基因能够抑制胰腺癌细胞生长、诱导胰腺癌细胞凋亡,可能具有抑制肿瘤细胞增殖的作用。

组织因子途径抑制物-2对胰腺癌细胞增殖的影响

目的:检测人胰腺癌组织中组织因子途径抑制物-2(TFPI-2)基因的表达,探讨其对胰腺癌细胞增殖的影响。方法:采用免疫组织化学方法检测43例胰腺癌及9例正常胰腺组织中TFPI-2及Ki-67蛋白的表达。结果:胰腺癌中TFPI-2的表达低于正常胰腺组织,其表达水平与胰腺癌临床分期及转移有关,于Ⅰ、Ⅱ期及无转移的胰腺癌组织中的表达高于Ⅲ、Ⅳ期及有转移的胰腺癌组织(P<0.05)。其表达水平与胰腺癌细胞增殖活性呈负相关(rs=-0.339,P<0.05)。结论:TFPI-2基因在胰腺癌中呈低表达,能抑制肿瘤细胞的增殖,可能参与了胰腺癌细胞周期的调控。

TFPI-2基因体外诱导胰腺癌Panc-1细胞的凋亡

目的:将TFPI-2基因转染胰腺癌细胞系Panc-1细胞,研究其对胰腺癌细胞凋亡的影响.方法:将重组质粒pEGFP-C1-TFPI-2通过脂质体介导转染胰腺癌细胞系Panc-1细胞,G418筛选获得阳性细胞克隆后,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹(Western blot)技术分别检测转染细胞中TFPI-2 mRNA及相应蛋白的表达,同时测定转染细胞的生长曲线和凋亡情况.结果:同转染空载体及未转染细胞相比,转染成功的Panc-1细胞可以检测到TFPI-2 mRNA和相应蛋白的表达,细胞生长受到抑制(n=9,P=0.02),DNA琼脂糖凝胶电泳显示凋亡细胞特有的"梯状"条带.结论:外源性TFPI-2基因能够抑制胰腺癌细胞生长增殖、诱导胰腺癌细胞凋亡.

胰管结石20例的诊断和治疗

胰管结石在临床上较为少见,正常人群中的发病率不超过1%,且与慢性胰腺炎关系密切,慢性胰腺炎病人90%伴有胰管结石。胰管结石发生率虽不高但常引起严重后果,如腹痛反复发作、进行性胰腺功能损害,甚至诱发胰腺癌等。

TFPI-2基因与消化道肿瘤关系的研究进展

组织因子途径抑制物2(tissue factor path-way inhibitor2,TFPI-2)是一种广谱的丝氨酸蛋白酶抑制物,可抑制包括纤溶酶、胰蛋白酶、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)在内的多种蛋白酶,而MMPs参与了细胞外基质的重塑,在肿瘤细胞的浸润和转移、伤口愈合、血管新生、纤维蛋白溶解及动脉粥样硬化等生理和病理过程中发挥重要作用。TFPI-2可通过维持细胞外基质的完整、调节肿瘤血管生成、调控肿瘤细胞细胞凋亡及血液凝固等机制调节胰腺癌、食管癌及胃癌等消化道肿瘤细胞的侵袭转移。越来越多的研究表明,TFPI-2能明显抑制肿瘤中MMPs的活性与功能等从而抑制肿瘤的侵袭与转移,并成为肿瘤基因治疗的新靶点。

硒对梗阻性黄疸肝细胞保护作用的研究

目的：探讨硒对梗阻性黄疸肝细胞的保护作用。 方法：用大鼠制备成梗阻性黄疸动物模型，通过生化检测和电镜观察补硒大鼠肝功能变化和肝细胞超微结构改变。 结果：硒能明显降低梗阻性黄疸大鼠血清谷丙转氨酶、总胆红素及直接胆红素（Ｐ＜ ０．０１），减轻肝细胞超微结构的损伤。 结论：硒对梗阻性黄疸肝细胞的结构和功能有一定的保护作用，是一种有应用前途的肝细胞保护剂。

改良保留尿道前列腺切除同期行无张力疝修补

目的:进一步提高前列腺增生症合并腹外疝的诊治水平。方法:回顾性总结自2001年1月～2002年9月收治的9例前列腺增生症合并腹外疝的临床资料,均行改良的保留尿道前列腺切除术+同期无张力疝修补。结果:9例病人切口愈合良好,术后8例随访1～21个月(平均15个月),排尿通畅,无疝复发。结论:改良的保留尿道前列腺切除同期行无张力疝修补是可行的,符合正常的解剖生理结构,术后患者具有痛苦少、恢复快、疝复发率低等优点。

胰腺癌TFPI-2的表达及与临床病理关系的分析

目的探讨人胰腺癌组织中TFPI-2蛋白表达及与临床病理参数的关系。方法应用免疫组化方法检测50例胰腺癌及9例正常胰腺组织中TFPI-2蛋白的表达,并应用TUNEL法检测细胞凋亡,计算凋亡指数（AI）。结果胰腺癌组织TFPI-2表达指数为73.28±9.63,明显低于正常胰腺组织的81.42±12.25（P〈0.05）。胰腺癌组织的AI为（7.19±1.77）%。胰腺癌TFPI-2表达指数及AI与临床TNM分期及转移有关,Ⅰ、Ⅱ期及无转移的胰腺癌组织TFPI-2表达指数及AI值均高于Ⅲ、Ⅳ期及有转移的胰腺癌组织;TFPI-2阳性表达的癌组织AI值为（7.77±0.25）%,TFPI-2阴性表达的癌组织AI值为（6.77±1.43）%,两者比较差异显著（P〈0.05）。结论胰腺癌组织TFPI-2呈低表达,TFPI-2可能在诱导胰腺癌细胞凋亡中起重要作用。

组织因子途径抑制物2基因真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建人组织因子途径抑制物2(tissuefactorpathwayinhibitor2,TFPI-2)基因的真核表达载体pEGFP-C1-TFPI-2,并对其进行酶切鉴定。方法:实验于2006-09/12在安徽省立医院中心实验室完成。实验方法:①从人胎盘组织中提取总RNA,反转录合成cDNA,以特异性引物扩增TFPI-2基因全长mRNA。②扩增产物回收纯化后用限制性内切酶酶切,与经同样处理的载体pEGFP-C1进行连接反应,连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α。③碱变性法提取质粒进行限制性内切酶酶切分析,并进行DNA序列测定。结果:①成功克隆了708bp的TFPI-2基因片段。②构建了人TFPI-2基因的真核表达载体pEGFP-C1-TFPI-2,经限制性内切酶酶切,电泳分析后得到了大小分别为708bp的目的基因片段和4.6kb的载体片段,测序结果与TFPI-2mRNA的cDNA序列吻合。结论:通过基因重组技术,构建了稳定表达TFPI-2的人TFPI-2的真核表达载体pEGFP-C1-TFPI-2。

胰腺癌中FFAR4蛋白和mRNA的表达及临床意义

目的检测FFAR4蛋白和mRNA在胰腺癌组织中的表达,分析其在胰腺癌进程中的作用和意义。方法采用免疫组化法分别检测62例经病理确诊的胰腺癌组织及对应癌旁组织中FFAR4蛋白表达及与胰腺癌临床病理特征的关系。同时使用Western bolt和qRT-PCR法检测20例胰腺癌及对应癌旁组织中FFAR4的表达。结果免疫组化结果表明FFAR4蛋白在胰腺癌中的高表达率为75.8%(47/62),比癌旁组织(40.3%,25/62)显著增高,差异有统计学意义(P<0.05);FFAR4高表达与胰腺癌分化程度、TNM分期、淋巴结转移有关(P<0.05)。Western blot及qRT-PCR检测显示胰腺癌组织中FFAR4蛋白及mRNA的表达量均显著高于对应癌旁组织,两组间差异有统计学意义(P<0.001)。结论 FFAR4表达失调可能与胰腺癌的发生、进展密切相关,有望成为胰腺癌术后进展、预后的有效标志物及临床治疗药物研究的新靶点。

腹腔镜技术在低位进展期直肠癌保肛手术中的应用

目的探讨腹腔镜技术在低位进展期直肠癌保肛手术中应用的临床疗效。方法回顾性分析126例低位局部进展期直肠癌患者病历资料,根据手术方式将患者分为开腹组及腹腔镜组,分析临床资料及随访情况。结果 126例低位局部进展期直肠癌患者经病理结合影像学证据明确诊断。其中开腹组70例,腹腔镜组56例。腹腔镜组患者术后尿管再插率、术后住院日均显著低于开腹组[尿管再插率:10/70比2/56,Logrankχ2=4. 145,P <0. 05;术后住院日:(5. 98±0. 98) d比(8. 37±3. 23) d,Logrankχ2=28. 552,P <0. 001]。腹腔镜组术后切口疼痛减轻,两组间出血、吻合口瘘、肺部感染、切口感染等手术并发症发生率、生存时间均差异无统计学意义。结论腹腔镜保肛手术在低位进展期直肠癌患者安全可行。