NORAD诱导的自噬促进食管胃结合部腺癌细胞对奥沙利铂耐药的研究

目的探讨DNA损伤激活的非编码RNA(NORAD)诱导细胞自噬对食管胃结合部腺癌(AEG)奥沙利铂耐药的影响及分子机制。方法收集2023年1月至6月安阳市肿瘤医院诊治的进展期AEG患者AEG及其癌旁正常组织手术标本4对,应用长链非编码RNA微阵列芯片分析AEG及其癌旁组织中NORAD的表达情况。使用新鲜AEG组织标本制备肿瘤组织来源的AEG细胞系(PDC),构建PDC和AEG细胞系OE19的奥沙利铂耐药细胞系(PDC-R、OE19-R),并通过转染shNORAD制备敲减NORAD的PDC-R和OE19细胞系(shNORAD PDC-R、shNORAD OE19-R)。应用生物信息学工具Starbase v3.0和DIANA-lncBase v3.0预测NORAD潜在靶点及其与微RNA-433-3p(miR-433-3p)的相互作用。PDC、PDC-R,OE19、OE19-R细胞分别共转染miR-144-3p和野生型NORAD(NORAD-WT)或突变型NORAD(NORAD-Mut)质粒,应用双萤光素酶报告实验验证NORAD与miR-433-3p的相关性。通过定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测胃正常黏膜细胞系GES-1及AEG细胞系PDC、PDC-R、shNORAD PDC-R、OE19、OE19-R、shNORAD OE19-R中NORAD和miR-433-3p表达水平,蛋白质印迹法检测上述细胞p62和微管相关蛋白1轻链3 B-Ⅱ(LC3B-Ⅱ)的表达。采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)测定奥沙利铂对PDC、PDC-R、shNORAD PDC-R、OE19、OE19-R和shNORAD OE19-R细胞的细胞半数抑制浓度(IC_(50))。统计学方法采用独立样本t检验。结果微阵列芯片分析发现与癌旁正常组织相比,AEG中NORAD表达显著上调(差异表达倍数≥2.0,P<0.05)。生物信息学研究发现miR-433-3p是NORAD的潜在靶点。双萤光素酶报告实验结果显示,在PDC和PDC-R细胞中,NORAD-WT组的相对萤光素酶活性低于NORAD-Mut组(0.441±0.104比0.928±0.204、0.449±0.112比0.947±0.201),差异均有统计学意义(t=-14.74、-14.94,均P<0.001);OE19和OE19-R细胞中双萤光素酶报告实验结果与PDC细胞系相同。qRT-PCR检测结果显示,NORAD在GES-1细胞中的相对表达量(1.016±0.213)低于PDC细胞(2.194±0.322)和PDC-R细胞(4.040±0.336),且在PDC细胞中相对表过量低于PDC-R细胞,差异均有统计学意义(t=-14.94、-37.21、-19.43,均P<0.001);在shNORAD PDC-R细胞中的相对表达量(0.290±0.165)则低于PDC-R细胞,差异有统计学意义(t=-49.05,P<0.001)。miR-433-3p在GES-1细胞中的相对表达量(1.017±0.248)高于PDC细胞(0.470±0.156)和PDC-R细胞(0.203±0.045),且PDC细胞中的相对表达量高于PDC-R细胞,差异均有统计学意义(t=9.15、15.85、8.11,均P<0.001),在shNORAD PDC-R细胞中的相对表达量(0.699±0.256)也高于PDC-R细胞,差异有统计学意义(t=9.37,P<0.001)。蛋白质印迹法检测结果显示,PDC-R中LC3B-Ⅱ相对表达量高于PDC细胞(0.426±0.060比0.212±0.041),shNORAD PDC-R细胞中LC3B-Ⅱ的相对表达量(0.155±0.029)低于PDC细胞,差异均有统计学意义(t=8.70、-79.45,均P<0.001);而p62在各细胞系中表现呈相反趋势,在PDC-R中相对表达量低于PDC(0.205±0.031比0.311±0.040),在shNORAD PDC-R中的相对表达量(0._(50)4±0.084)高于PDC,差异均有统计学意义(t=-31.19、62.80,均P<0.001)。在OE19细胞系的原始细胞、耐药细胞和NORAD敲减细胞中NORAD和miR-433-3p,以及LC3B-Ⅱ和p62表达变化规律与PDC细胞系相似。CCK-8评估靶细胞活力发现,奥沙利铂对PDC、PDC-R和shNORAD PDC-R细胞的IC_(50)值分别为14.28、22.27和2.51μg/mL,对OE19、OE19-R和shNORAD OE19-R细胞的IC_(50)值分别为3.95、8.12和1.89μg/mL。结论NORAD在AEG组织及细胞中呈高表达;在奥沙利铂耐药的细胞呈过表达,而且增加了细胞的自噬活性。敲减NORAD后AEG细胞自噬活性受到抑制,而且AEG细胞对奥沙利铂的敏感性增加。