阪崎肠杆菌α-葡萄糖苷酶基因克隆、表达及活性研究

目的:利用pET质粒原核表达体系克隆、表达阪崎肠杆菌α-葡萄糖苷酶基因,表达产物进行Ni-NTA柱纯化,利用α-葡萄糖苷酶分解4-硝基苯基-α-D-呋喃型葡萄糖的特性进行表达纯化合的蛋白活性鉴定,为进一步制备阪崎肠杆菌检测用单克隆抗体奠定了基础。方法:从阪崎肠杆菌ATCC29544标准菌株中克隆获得阪崎肠杆菌α-葡萄糖苷酶基因,连接pET22b(+)表达载体后转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,利用不同浓度的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达外源基因,分别检测不同诱导时间、不同浓度IPTG作用下表达产物,筛选高表达菌株。表达菌株大量培养后,超声波及蛋白酶K作用破菌,Ni-NTA亲和柱纯化目的蛋白,纯化产物进行酶活性的测定。结果:克隆获得的α-葡萄糖苷酶基因与NCBI收录的基因序列属等位基因,核苷酸位点有多处差异,氨基酸序列也有不同。构建表达载体并诱导表达后,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测,目标蛋白相对分子质量约为65kD,与理论值相符。目标蛋白量约占菌体总蛋白量的18%。同时,由纯化结果可以看出,以500mmol/L咪唑洗脱时的纯化效果最理想,蛋白纯度可达90%以上。对表达产物进行过酶活性初步检测证明,重组的阪崎肠杆菌α-葡萄糖苷酶能够分解4-硝基苯基-α-D-呋喃型葡萄糖,产生蓝绿色。结论:本研究中克隆获得了阪崎肠杆菌α-葡萄糖苷酶基因,通过构建pET22b(+)-Glu表达质粒转化大肠杆菌可获得基因重组的高表达菌株,表达产物具有较好的酶活性,纯化后纯度可达90%以上。

苯并[a]芘在厚壳贻贝体内的富集及代谢特征

通过实验室生态毒理实验,研究了厚壳贻贝(Mytilus coruscus)暴露在不同浓度(0.2、1.0、3.0μg·L^(-1))苯并[a]芘(benzo[a]pyrene,BaP)水溶液中,其内脏团、外套膜、闭壳肌对BaP的富集和释放规律,以及3个组织中代谢物质3-羟基苯并[a]芘(3-hydroxybenzo[a]pyrene,3-OH BaP)与BaP之间时间与剂量的效应关系。结果显示,厚壳贻贝3个组织对BaP的富集含量、吸收速率和释放速率均表现为:内脏团>外套膜>闭壳肌。厚壳贻贝3个组织中代谢产物3-OH BaP随BaP暴露时间的增加而增加,也随着各组织内BaP富集含量的增加而增加,即厚壳贻贝内脏团、外套膜和闭壳肌中3-OH BaP和BaP均显著的呈现时间与其剂量效应的正相关关系。研究结果初步阐明BaP代谢物3-OH BaP在厚壳贻贝各组织中的代谢规律,可为研究BaP在贝类体内代谢转化机制提供重要的参考数据。

利用β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶快速酶切分析中国仓鼠卵巢细胞表达的西妥昔单抗抗原结合区的聚糖比例

西妥昔单抗具有较复杂的糖基化修饰,在抗原结合片段(Fab)和可结晶片段(Fc)的重链上都含有2个N-糖基化位点,其中Fab段的糖基化最为复杂,要研究清楚该位点的糖基化修饰,开发专一性切糖技术和稳定的聚糖比例分析方法是当前迫切需要解决的难题。以中国仓鼠卵巢(CHO)细胞表达的西妥昔单抗为研究对象,使用β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(Endo F2)开发了一种快速Fab段聚糖释放的方法,利用超高效液相色谱-高分辨质谱(UPLC-HRMS)进行了定性和聚糖比例分析。第一步对抗体原液进行非变性酶切,抗体原液经超纯水稀释后,加入糖苷酶Endo F2进行酶切,通过质谱对质量数的解析,结果表明Endo F2酶切时间5 min,Fab段的聚糖就能完全切除,而Fc段的聚糖不受影响,实现了快速酶切,而且切糖具有很好的专一性。第二步对Fab段聚糖进行比例分析,将释放的聚糖经对氨基苯甲酰胺(2-AB)荧光标记后使用超高效液相色谱联用荧光检测器(FLR)进行检测,在亲水作用色谱(HILIC)柱上得到良好的分离并可以进行稳定地聚糖比例分析。3次独立试验结果表明,酶切后的质谱图基本一致,且聚糖的比例结果也基本一致,表明Endo F2酶切方法和聚糖比例分析方法都具有较好的稳定性和可靠性。此外,通过测定来自两个不同工艺生产的样品,数据显示两者的糖谱上具有非常明显的差异,表明利用开发的方法可以实现对抗体生产工艺进行监测研究,对抗体生产工艺的评估具有非常重要的意义。

利用N糖苷酶F对单克隆抗体N糖酶解条件的优化

为了优化利用N糖苷酶F(PNGase F)酶解单克隆抗体中N糖的方法,应用本公司生产的单抗对PNGase F酶的酶解条件进行优化,包括缓冲液pH、酶种类、仪器、酶解程度、变性缓冲液及酶加入量等,总结酶解条件对N糖谱结果的影响。结果显示,置换缓冲液至1×PBS中可以避免某些单抗在低pH酶解时G0F转化为G0F-GN并可改善峰型;快速PNGase F和加入变性缓冲液能有效提高酶解效率;UPLC和1.7μm粒径色谱柱能提高分离度;不完全酶解影响N糖含量结果。研究结果表明,采用优化的酶解条件可快速、有效的酶解单抗上的N糖,使N糖谱结果准确可靠,为细胞株筛选和单抗药物质量控制提供有效手段。

高效液相色谱-荧光检测器法检测单克隆抗体注射液中吐温80的含量

目的:采用高效液相色谱-荧光检测器法(HPLC-FLD)测定单克隆抗体注射液中吐温80的含量,并进行方法学验证。方法:按设定的色谱条件对检测单克隆抗体注射液中吐温80含量的HPLC-FLD法进行方法学验证,包括专属性、精密度、准确度、线性和范围、耐用性,并采用该方法对不同单克隆抗体注射液进行检测。结果:经验证,该方法具有专属性;重复性验证试验中,保留时间和含量的RSD值分别为0.5%和0.4%;中间精密度验证试验中,保留时间和含量的RSD值分别为0.4%和2.2%;准确度验证试验中,回收率分别为105%、98%和108%;线性相关系数为0.9991,检测范围为0.05~0.80 mg/mL;不同批次反应线圈对检测结果无影响,不同品种单克隆抗体注射液吐温80含量检测结果偏差较小。结论:该方法具有专属性,线性关系良好,精密度和准确度较好,测定结果稳定可靠,适用于单克隆抗体注射液中吐温80含量的检测。

单抗药物A003的影响因素试验研究

本研究对单抗药物A003进行了影响因素试验研究,包括光照、高温、剧烈振荡、低温循环、冻融循环、酸碱破坏、氧化破坏等试验研究,考察外观、蛋白质含量、pH、渗透压摩尔浓度、电荷异质性、纯度、生物活性等质量属性的变化。结果表明:(1)单抗药物A003对光照、高温、氧化破坏等比较敏感,电荷异质性结果显示主峰比例明显降低、酸性峰比例明显升高,纯度明显降低,聚体比例明显升高,其中氧化破坏导致抗原结合活性、细胞水平活性结果由107%、110%分别降低至43%、42%;(2)剧烈振荡、碱破坏(pH9.5)对A003有轻微影响,CEX、cIEF检测主峰比例均有下降趋势,酸性峰比例均有升高趋势,纯度有轻微降低;(3)A003在低温循环、冻融循环、酸破坏(pH3.0)等试验条件下,比较稳定,无明显变化。提示该产品在生产、储存及运输中,应避免接触空气,高温、光照及剧烈振荡。

Claudin18.2和CD47双特异性抗体的小鼠体内药效评价

目的评估Claudin18.2和CD47双特异性抗体(双抗)在小鼠肿瘤模型中的治疗效果。方法 CB-17 SCID小鼠皮下接种胰腺癌BxPC3-hClaudin18.2细胞或结肠癌HT29-hClaudin18.2细胞,然后经尾静脉注射和腹腔注射交替给予双抗或抗Claudin18.2单克隆抗体(单抗)、抗CD47单抗,监测小鼠肿瘤体积和质量变化,依据瘤体积抑瘤率(tumor growth inhibition of tumor volume,TGItv)和瘤重抑瘤率(tumor growth inhibition of tumor weight,TGItw)评价双抗疗效。结果在胰腺癌模型中,低、中、高剂量双抗组的TGItv分别为47.12%、85.90%和86.48%,TGItw分别为44.16%、80.00%和74.46%。在结肠癌模型中,低、中、高剂量双抗组的TGItv分别为39.30%、48.54%和82.27%,TGItw分别为23.29%、31.53%和73.46%;在同一剂量条件下,抗Claudin18.2单抗组、抗CD47单抗组以及双抗组的TGItv分别为26.60%、21.07%和84.99%,TGItw分别为20.59%、16.30%和78.67%。结论 Claudin18.2和CD47双抗可以有效抑制癌细胞的生长,且动物体内疗效显著优于各单抗,对于肿瘤有较好的治疗潜力。

定量检测人血清中可溶性PD-L1蛋白浓度的方法开发及验证

目的:建立一种基于电化学发光法的高灵敏度、高特异性、快速的人血清中可溶性PD-L1(sPD-L1)浓度的定量检测方法,并对该方法进行全面验证。方法:基于Meso Scale Discovery(MSD)技术平台,以鼠抗体PD-L1抗体(mouse anti-human PD-L1 antibody)作为捕获抗体,并采用生物素标记的羊抗人PD-L1抗体(biotinylated goat anti-human PD-L1 antibody)作为检测试剂,定量检测人血清中sPD-L1浓度。该研究对检测方法的关键参数进行了优化,并对该方法的定量范围、准确度和精密度、回收率、稳定性、稀释线性、选择性等性能进行方法学验证。结果:建立了高灵敏度、高特异性的快速检测人血清中sPD-L1的MSD方法并完成方法学验证。该方法定量范围为9.375~1200 pg·mL^(-1),精密度、准确度、回收率、稀释线性及选择性良好,样品室温放置4.3 h,稀释处理后实验台放置4.3 h,冷藏冰箱(2℃~8℃)存放24.4 h,经冻融3次,超低温冰箱(-90℃~-70℃)放置101 d稳定。结论:经过方法学验证,该方法可以用于血清中sPD-L1浓度的定量分析,为PD-1/PD-L1免疫检查点相关药物的临床研究药效学评价提供理论依据,在个性化治疗和伴随诊断领域也有潜在的应用价值。

两种重组抗表皮生长因子受体人鼠嵌合单克隆抗体临床前安全性相似性评价

目的比较国产抗表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)人鼠嵌合单克隆抗体CDP1与进口抗EGFR单抗(以下简称进口单抗)临床前安全性的相似性。方法将50只食蟹猴随机分为溶媒对照组、CDP1低剂量组(5 mg/kg)、中剂量组(50 mg/kg)、高剂量组(100 mg/kg)和进口单抗对照组(50 mg/kg),每组10只,雌雄各半。每周静脉给药1次,共5次,恢复期6周。定期对动物进行一般观察,监测体重、摄食量、体温、眼检、尿检、血液生化和血液学指标,并检测心电图、血压、呼吸等安全药理学指标,于给药后不同时间点进行血样采集,进行毒代动力学和血清抗药抗体(anti-drug antibody,ADA)分析,给药结束后和恢复期末进行大体解剖和组织病理学检查。结果CDP1(5～100 mg/kg)连续5周给药,CDP1各剂量组均耐受良好,无明显可见毒性剂量为5 mg/kg,毒性剂量为50 mg/kg;CDP1和进口单抗毒性靶器官(靶部位)毒性反应和组织病理学变化相似,毒性靶器官均为消化系统(肝脏、胃肠道)、血液系统(红细胞、白细胞)和皮肤,毒性作用可逆或部分有可逆趋势,皮肤和胃肠道毒性与药物作用机制有关;CDP1中剂量组和进口单抗对照组主要毒代参数差异无统计学意义(P> 0. 05);ADA发生率相同。结论 CDP1不同剂量组均耐受良好,同等剂量下,CDP1和进口单抗在临床前安全性相似,为该药作为生物类似药进行临床试验提供了初步的安全性数据。

肿瘤临床试验中心化监查实施与效果评价分析

近年来我国法规越来越推荐临床试验进行中心化监查作为风险管理体系的一部分,以提升临床试验质量管理工作的效率和质量。本文通过excel工具,围绕EDC系统、TMF文件、安全性报告等方面,对肿瘤Ⅰ/Ⅱ期临床试验项目实施中心化监查,并对实施考量、关键数据的中心化监查要点以及对基于中心化监查效果评价分析进行阐述,以期为抗肿瘤生物制药企业提供实施中心化监查的可行性思路。