基于辅助生殖人群的染色体多态性回顾性研究

目的 分析染色体多态性对辅助生殖人群的影响。方法 回顾性分析2016年1月至2019年11月在山东大学附属生殖医院行辅助生殖技术的91 908例患者(45 954对夫妇),将夫妇双方染色体核型皆正常的设为对照组(1 189例),根据染色体多态性的不同形态,将男性染色体多态性患者分为Y组、inv(9)组、D/G组、1qh+组、9/16组,将女性染色体多态性患者分为inv(9)组、D/G组、1/9/16组。对男性染色体多态性患者的精子浓度、精子总活力、促卵泡生成素(FSH)、促黄体生成素(LH)、睾酮(T)、垂体催乳素(PRL)进行比较,对女性染色体多态性患者的获卵数、FSH、LH、雌激素(E2)、T、PRL、促甲状腺激素(TSH)进行比较。结果 91 908例患者(45 954对夫妇)检出男性染色体多态性4 018例,女性患者染色体多态性3 100例,男性检出率高于女性(P<0.05);与对照组比较,Y组精子浓度和精子总活力降低,FSH和LH水平升高(P<0.05);与对照组比较,Y组中Yqh-、del(Y)患者精子浓度、精子总活力降低,FSH和LH水平升高,Yqh+患者精子浓度、精子总活力降低(P<0.05);与对照组比较,inv(9)组获卵数减少(P<0.05)。结论 男性染色体多态性中的Yqh+、Yqh-对精液质量、激素水平有一定的影响,女性染色体多态性中的9号染色体倒位对获卵数有一定的影响。

新城疫病毒F蛋白细胞融合活性位点中保守氨基酸基因突变分析

为了确定新城疫病毒融合蛋白(F)分子上活性位点中保守氨基酸在F蛋白的细胞融合作用,弄清F细胞融合的分子机理,采用基因定点突变法,创造一个酶切位点,用酶切反应初步筛选突变株,然后用DNA序列分析进一步确定,并于真核细胞内进行表达,Giemsa染色定性和指示基因法定量检测细胞融合功能,荧光强度分析(FACS)检测表达效率情况。结果表明,NDV F第117位苯丙氨酸(F)突变成亮氨酸(L)时对细胞融合作用没有显著影响。R112和K115同为保守序列,分别突变为G时,细胞融合活性只有原来的44%,下降了56%。细胞表面表达效率没有明显的改变。N147突变为K时,细胞融合活性明显下降,只有原来的15%,而细胞表面表达效率没有明显的改变。L154为保守序列,突变为K时,细胞融合活性消失,说明L154是一个非常关键的氨基酸,对维持F蛋白的细胞融合活性非常重要。细胞表面表达效率也有所下降(为原来的94%)。D462属于高度保守氨基酸,当突变为N时,细胞融合活性消失,但经细胞表面表达效率分析证明,此突变蛋白未表达于细胞表面,证明在细胞浆转运至细胞表面的过程中发生了问题。当突变为R和E时,细胞融合活性未发生改变,但细胞表面表达效率有所下降,分别为野毒株的63%和44%。说明NDV F分子上与HN相互作用的特异性区域中的某些保守氨基酸在细胞融合中发挥着重要作用,对F蛋白的折叠、加工、转运等,发挥着不同作用,从而影响F蛋白的细胞融合作用和/或在细胞表面的表达量。

中国山东汉族人群TIM-3基因启动子区域两单核苷酸多态与支气管哮喘的相关性

目的:检测中国山东汉族人群T细胞免疫球蛋白域和粘蛋白域蛋白-3(T-cell immunoglobulin do-main and mucin domain protein-3,TIM-3)基因启动子区域的单核苷酸多态(single nucleotide polymorphism,SNP)位点T-882C以及T-574G的多态性,探讨TIM-3基因启动子区域的单核苷酸多态与汉族人群支气管哮喘易感性的关系。方法:采用聚合酶链反应-限制性片断长度多态性(polymerase chain reaction and restriction fragmentlength polymorphism,PCR-RFLP)法检测449例哮喘患者以及386例正常对照TIM-3基因启动子区域单核甘酸多态位点T-882C及T-574G的基因型,计算基因型频率及等位基因频率,进行χ2检验。结果:T-882C及T-574G在中国汉族人群中处于完全连锁不平衡状态,其基因型频率及等位基因频率一致;T-882C位点TT/TC/CC基因型频率以及T-574G位点TT/TG/GG基因型频率在病例组中为0/0.042 3/0.957 7,在对照组中为0/0.018 1/0.981 9;两位点的基因型、等位基因分布以及单倍体型分布在哮喘组与对照组之间均有统计学差异。结论:中国汉族人群TIM-3基因启动子区域单核苷酸多态T-882C、T-574G与支气管哮喘易感性相关。

高三尖杉酯碱白血病多药耐药细胞系K562/HHT的诱导及米非司酮逆转耐药的研究

目的:研究高三尖杉酯碱(HHT)诱导的白血病多药耐药细胞株耐药机制以及米非司酮(RU486)逆转其耐药效应。方法:采用反复短期暴露并逐渐增加HHT浓度的方法建立白血病多药耐药细胞系K562/HHT,MTT法检测K562/HHT细胞对化疗药物的敏感性及RU486对该细胞的细胞毒效应,RT-PCR法检测细胞MDR1基因、葡萄糖神经酰胺合成酶(GCS)基因的表达,流式细胞术检测细胞P-糖蛋白的表达和柔红霉素积累量,免疫组化法检测细胞Bcl-2、Bax、caspase-3的表达状况。结果:成功诱导出多药耐药细胞系K562/HHT,K562/HHT较其亲代细胞K562对HHT、阿霉素、长春新碱、依托泊苷的耐药性分别提高462.6、2.8、1183.4、2.6倍,K562/HHT细胞MDR1基因、GCS基因、P-糖蛋白和Bcl-2/Bax比值明显高于K562细胞(P<0.05),caspase-3表达、柔红霉素积累量明显低于K562细胞(P<0.05)。10μmol/L的RU486对K562/HHT细胞无明显杀伤(存活率94.67%±2.48%),该浓度RU486可不同程度地逆转K562/HHT细胞对上述化疗药物的耐药性,RU486作用后K562/HHT细胞caspase-3表达、柔红霉素积累量明显高于作用前(P<0.05),Bcl-2/Bax比值明显低于作用前(P<0.05)。结论:白血病细胞系K562在HHT的作用下可形成多药耐药细胞系K562/HHT,其耐药性的形成与P-糖蛋白、GCS、Bcl-2/Bax比值及caspase-3等机制有关,RU486可通过提高细胞内药物积累、调节Bcl-2/Bax比值和caspase-3的表达逆转此细胞的耐药性。

嗜酸乳杆菌作用人巨噬细胞后对其抗宫颈癌细胞作用影响的研究

目的诱导获得人外周血巨噬细胞(MΦ),研究嗜酸乳杆菌作用MΦ后对其抗肿瘤效应的影响及机制。方法自正常人外周血分离获得单核细胞,体外rhGM-CSF诱导培养,观察细胞形态并检测其相关表型;利用MTT法检测所诱导MΦ对宫颈癌细胞HeLa的直接抑瘤效应;ELISA法检测其培养上清中TNF-α及IL-12的含量。结果诱导7d的贴壁细胞具有典型的MΦ形态,流式分析显示为分化成熟的MΦ;体外细胞毒实验显示:嗜酸乳杆菌活菌状态和热灭活状态以10∶1、1∶1与MΦ相互作用后能够显著增强MΦ对HeLa细胞的杀伤作用(P<0.05),激活后的MΦ在一定效靶比为10∶1时其肿瘤抑制率最大,与LPS阳性对照相比,其抗瘤活性差异不存在显著性(P>0.05);经嗜酸乳杆菌活菌和热灭活菌作用的MΦ能显著提高IL-12和TNF-α两种细胞因子的分泌量,而且存在剂量依赖性,与空白对照组比较差异存在显著性(P<0.05)。结论两种生物状态的嗜酸乳杆菌均能够增强人MΦ抗宫颈癌细胞作用。

小鼠Lrp5基因启动子的克隆及功能分析

为分析小鼠LDL受体相关蛋白 5 (Lrp5 )基因启动子的结构与功能 ,采用DNA重组技术 ,构建了 7种含小鼠Lrp5基因启动子荧光素酶报告基因表达体系 ,分别为 :pGL3 10 3(- 10 3bp～ + 132bp) ,pGL3 30 3(- 30 3bp～ + 132bp) ,pGL3 4 99(- 499bp～ + 132bp) ,pGL3 70 8(- 70 8bp～ + 132bp) ,pGL3 90 9(- 90 9bp～ + 132bp) ,pGL3 10 34(- 10 34bp～ + 132bp ) ,pGL3 12 2 9(- 12 2 9bp～ + 132bp) .以pRL TK为内参照质粒 ,瞬时转染成骨细胞株 (U2OS )及非成骨细胞株 (COS 7) ,收集细胞测定荧光素酶相对表达活性 .7种荧光素酶表达质粒在 2种细胞中表达无显著差异 ,即在所分析的小鼠Lrp5基因的 136 1bp(- 12 2 9bp～ + 132bp)范围内 ,不存在成骨细胞特异的表达元件 ;而且 7种表达质粒在 2种细胞中呈现相似的变化趋势 ,pGL3 10 3表达活性最高 ,pGL3 12 2 9表达活性显著降低 .表明小鼠Lrp5基因转录所必需的基本启动子序列在 - 10 3bp～ + 1bp范围内 ,- 10 34bp～ - 12 2 9bp之间的 195bp片段内可能含有负调控元件 .

热灭活嗜酸乳杆菌黏附于HeLa细胞后肿瘤细胞免疫学性状的变化

目的:比较热灭活嗜酸乳杆菌黏附于宫颈癌HeLa细胞后对肿瘤细胞免疫学性状的影响。方法:运用流式细胞技术检测热灭活嗜酸乳杆菌黏附于HeLa细胞后免疫分子表达状况,运用MTT法分析淋巴细胞对HeLa细胞的杀伤作用。结果:热灭活的嗜酸乳杆菌黏附于HeLa细胞后不影响MHC-I分子的表达(P>0.05),可显著增强CD80、CD86的表达,并且可以显著增强NK细胞对其杀伤活性(P<0.05)。细胞毒性淋巴细胞(CTL)对热灭活嗜酸乳杆菌黏附的HeLa细胞的杀伤作用显著高于对照组(P<0.05)。结论:热灭活嗜酸乳杆菌黏附于宫颈癌HeLa细胞后可增强其诱导抗肿瘤效应。

IL27p28基因启动子区域-964A>G位点多态性与中国汉族人群支气管哮喘的相关性

目的检测中国汉族人群IL-27p28基因启动子区域一个单核苷酸多态位点-964A>G的多态性,探讨该位点多态性与中国汉族人群支气管哮喘易感性的关系。方法采用聚合酶链式反应—限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法检测360例哮喘患者和220例正常对照者IL-27p28基因启动子区域单核苷酸多态位点-964A>G的基因型,计算基因型频率和等位基因频率,对比分析两组基因频率和基因型频率分布。结果IL-27p28基因启动子区域-964A>G位点在中国汉族人群中具有多态性,其基因频率与基因型频率分布在病例组和对照组中均符合Har-dy-Weinberg平衡,基因型AA、GA和GG的频率在病例组分别为0.402 8、0.420 5和0.172 2,在对照组中分别为0.431 80、.445 5和0.122 7;该位点的基因型频率及等位基因频率在病例组和对照组间的差异均无统计学意义(P=0.274),提示该多态位点与中国汉族人群哮喘无显著相关性。结论IL-27p28基因启动子区域单核苷酸多态-964A>G与中国汉族人群支气管哮喘易感性没有显著相关性。

山东汉族人群STAT4基因启动子区域单核苷酸多态与支气管哮喘的相关性

目的分析信号转导子及转录激活因子4(signal transducer and activator of transcription4,STAT4)基因启动子区域单核苷酸多态(single nucleotide polymorphism,SNP)位点rs16833431A>G多态性与山东汉族人群支气管哮喘发生的相关性。方法采用聚合酶链式反应-限制性片断长度多态(polymerase chain reactionand restrictionfragment length polymorphism,PCR-RFLP)方法检测220例哮喘患者和233例正常对照STAT4基因启动子区域多态位点rs16833431A>G的基因型,计算基因型与基因频率,采用χ2检验进行组间比较。结果STAT4基因rs16833431多态位点AA、AG、和GG基因型频率在病例组中分别为0.536、0.377和0.086,在对照组中分别为0.515、0.399和0.086,A和G等位基因的频率在病例组分别为0.725和0.275,在对照组分别为0.715和0.285,该位点基因型和等位基因分布在病例组与对照组均无统计学差异。结论STAT4基因启动子区域rs16833431A>G位点单核苷酸多态与山东汉族人群哮喘发生无明显相关性。

人巨细胞病毒感染致血管内皮细胞损伤机制的研究

目的观察人巨细胞病毒(HCMV)感染对人血管内皮细胞氧化应激的影响及对血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)和糖基化终产物受体(RAGE)时序性表达的影响,研究HCMV感染致动脉粥样硬化(AS)的作用机制。方法用HCMV感染血管内皮细胞,用激光共聚焦显微镜检测细胞内活性氧(ROS)的改变;采用RT-PCR方法检测不同感染时段细胞VCAM-1及RAGEmRNA的表达。结果HCMV感染血管内皮细胞后,HCMV组荧光强度显著高于对照组(P<0.01)。感染0 h时,VCAM-1 mRNA有基础水平的表达,4 h开始升高,8 h时达高峰,12 h开始回落,24 h回落更明显,与0 h比较,均有统计学意义(P<0.01),48 h接近0 h表达水平(P>0.05)。感染0 h时,RAGEmRNA有基础水平的表达,4 h开始升高,8 h时表达水平明显升高,随感染时间延长,表达量逐渐增高,感染24 h时达高峰,48 h开始回落,仍维持在较高的水平,各时段与0 h比较,均有统计学意义(P<0.01)。结论HCMV感染血管内皮细胞后能够增强氧化应激,促进VCAM-1及RAGE的mRNA表达,并且呈时间依赖性。HCMV有可能通过增强氧化应激、上调VCAM-1及RAGE的表达介导血管内皮细胞的炎症反应,促进动脉粥样硬化的发生、发展。

COX-2在人膀胱移行细胞癌中的表达

目的:检测在人膀胱移行细胞癌(transitional cell carcinoma of bladder,BTCC)组织和正常膀胱组织中COX-2 mRNA和COX-2蛋白的表达,探讨COX-2在人BTCC中发生发展的作用。方法:应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫组织化学技术检测人BTCC和正常膀胱组织中COX-2 mRNA和COX-2蛋白的表达,并行统计分析。结果:RT-PCR检测13例新鲜BTCC组织COX-2mRNA均阳性表达,7例正常膀胱粘膜中无阳性表达,两者差异有统计学意义(P<0.01)。免疫组织化学研究结果与RT-PCR相似,COX-2蛋白主要集中在肿瘤细胞胞浆内,阳性表达率为55.74%,正常膀胱粘膜中没有表达。结论:COX-2 mRNA和蛋白在人BTCC组织中表达增高,COX-2蛋白的表达强度与肿瘤的分级和分期有关,表达强度随肿瘤恶性程度的增加而增加,说明COX-2可能在BTCC的发生发展中起着重要作用。

影响RNA剪接的基因变异

发现和正确解读疾病相关突变是遗传病分子诊断和临床指导的关键。尽管二代测序技术的应用显著改善了突变检测效率,但解读突变的生物学效应仍然存在挑战。目前对基因检测结果的解读更多地关注突变对蛋白质结构和功能的影响,而忽视了基因变异对RNA剪接的影响。越来越多的证据显示引起RNA剪接异常的基因变异在疾病发生中发挥重要作用。本文对影响RNA剪接的主要突变类型和确认方法进行介绍,以期为准确判断突变的遗传效应提供参考。

祛毒养心冲剂对病毒性心肌炎的疗效及机制

目的探讨祛毒养心冲剂对病毒性心肌炎(VMC)的疗效及作用机制。方法将60只小鼠随机分为正常对照组、病毒组、药物组,每组20只。后两组小鼠每只腹腔注射柯萨奇病毒(CVB3)液,正常对照组腹腔注射不含病毒的Eagle′s液。药物组于接种病毒后24 h灌胃给予祛毒养心冲剂。21 d后,处死所有小鼠并取其心脏。进行心肌病理检查,采用实时荧光定量PCR法和免疫组化技术检测心肌组织中白细胞介素-6(IL-6)mRAN和蛋白的表达。结果与病毒组相比,应用祛毒养心冲剂治疗后,小鼠心肌组织病变积分显著下降(P<0.05),心肌组织中IL-6的表达明显降低(P<0.05)。结论祛毒养心冲剂对VMC具有明显治疗作用,其作用机制是通过抑制IL-6在心脏中的表达而实现的。

小鼠Lrp5基因基本启动子分析

目的:研究小鼠Lrp5基因基本启动子。方法:PCR扩增小鼠Lrp5基因基本启动子序列,构建荧光素酶报告基因表达体系,以PRL鄄TK为内参照质粒,瞬时转染COS鄄7细胞熏48h后收集细胞测定荧光素酶相对表达活性。结果:在小鼠Lrp5基因基本启动子区域,构建了三种荧光素酶报告基因表达体系pGL3鄄16(鄄16bp～+132bp)、pGL3鄄54(鄄54bp～+132bp)和pGL3鄄103(鄄103bp～+132bp)。pGL3鄄103表达载体的相对荧光素酶活性最高;pGL3鄄54的相对荧光素酶活性是pGL3鄄103表达载体的80%;而pGL3鄄16相对荧光素酶表达活性急剧下降,与阴性对照pGL3鄄basic的活性相近,无启动子活性。结论:鄄54bp～鄄16bp区域内含有小鼠Lrp5基因转录所必需的基本启动子序列,其中三个SP1保守序列是小鼠Lrp5基因基本启动子所必需的。

胚胎干细胞关键因子Nanog在人胶质瘤中的表达及意义

目的探讨胚胎干细胞关键因子Nanog在人胶质瘤中的表达及意义。方法通过免疫荧光双标技术,分析40例胶质瘤组织内胚胎干细胞关键因子Nanog与肿瘤干细胞相关基因Nestin、CD133及胚胎干细胞全能性相关基因Oct4的共表达情况,并通过RT-PCR、Western blotting技术分析胶质瘤组织内Nanog与脑胶质瘤恶性程度之间的关系。结果 Nanog在胶质瘤组织中的表达随着胶质瘤病理级别增高而升高,而且超过50%的Nanog阳性细胞同时表达Nestin和CD133。95%以上的Nanog阳性细胞都同时表达胚胎干细胞全能性相关基因Oct4。结论胶质瘤组织中Nanog多表达在肿瘤干细胞中,与胶质瘤的恶性程度呈正相关,在胶质瘤的发生、发展过程中起着重要作用,为研究胶质瘤的起源及胶质瘤的诊断和预后判断提供帮助。

实时荧光定量PCR反应检测宫颈脱落细胞人乳头瘤病毒16/18型和巨细胞病毒的协同感染

目的探讨宫颈脱落细胞人乳头瘤病毒16/18型和巨细胞病毒协同感染的关系。方法采用实时荧光定量PCR反应(FQ-PCR)同时检测两种病毒的感染率。结果38例宫颈癌中检出HPV16/18型35例(阳性率92.11%),CMV11例(阳性率28.95%)。32例宫颈癌前病变(CIN)中检出HPV16/18型20例(阳性率62.50%),CMV7例(阳性率21.87%)。30例正常宫颈脱落细胞中检出HPV16/18型5例(阳性率16.67%),未检出CMV。结论宫颈脱落细胞HPV16/18型感染率随宫颈病变程度的加重而升高,且差异有显著性(P<0.05),CMV感染率随宫颈病变程度的加重而升高但差异无显著性(P>0.05),CMV仅是协同HPV16/18型感染导致宫颈癌的发生。

窄范围pH梯度干胶条可提高胃癌细胞蛋白质组表达谱分辨率

目的 探讨不同pH梯度干胶条在提高胃癌细胞蛋白质表达谱分辨率中的作用,为深入研究胃癌的蛋白质组学奠定基础.方法 提取胃低分化腺癌细胞MGC-803的蛋白质,分别采用pH 3～10和pH4～7不同pH梯度干胶条建立胃低分化腺癌细胞MGC-803蛋白质双向凝胶电泳图谱,与相对应pH区域的蛋白质斑点进行比较.结果 成功地构建出两种不同pH梯度MGC-803细胞的双向凝胶电泳图谱,经比较两种图谱蛋白质斑点结果显示,运用窄范围pH 4～7干胶条可更有效分辨出pH 3～10部分区域内聚积的蛋白质斑点.结论 采用窄范围pH的干胶条可提高双向电泳图谱分辨率,优化了胃癌细胞蛋白质组学研究的技术体系,可有效获取待测靶蛋白.

小鼠Lrp5基因5′端调控区域的功能

为研究小鼠低密度脂蛋白(LDL)受体相关蛋白5(LRP5)基因5′端调控序列的功能,PCR扩增小鼠Lrp5基因翻译起始位点上游3041bp(-2909bp^+132bp)DNA序列.PCR产物定向克隆到pGL3-basic载体上,重组质粒命名为pGL3-2909.以pGL3-2909质粒为模板,以不同的引物扩增出不同长短的DNA片段,分别定向克隆到含小鼠Lrp5基因基本启动子并含有荧光素酶报道基因的pGL3-103载体上,构建了12种荧光素酶报告基因表达体系:pGL3-267,pGL3-513,pGL3-535,pGL3-560,pGL3-575,pGL3-623,pGL3-645,pGL3-719,pGL3-770,pGL3-1032,pGL3-1330,pGL3-1619.以pRL-TK为内参照质粒,瞬时转染COS-7细胞,48h后收集细胞测定荧光素酶相对表达活性,pGL3-575(-2909bp^-2334bp)活性是pGL3-513(-2909bp^-2396bp)的20%,pGL3-535(-2909bp^-2374bp)的活性是pGL3-513的44%,pGL3-575的活性是pGL3-560(-2909bp^-2349bp)的48%,均有显著性差异.结果表明,在-2396bp与-2374bp之间的22bp区域内以及-2349bp与-2334bp之间的15bp区域内存在负调控元件.软件分析表明,此区域含有IK2,LYF1及MZF1调控元件.

小鼠LRP5基因负调控区分析

为研究小鼠LRP5基因-1 229 bp^-1 034 bp之间存在的负调控区,在此区域内构建了3种荧光素酶报告基因表达载体,即pGL3-1229(-1 229 bp^-914 bp),pGL3-1130(-1 130 bp^-914 bp)及pGL3-1051(-1 051 bp^-914 bp)。以PRL-TK为内参照质粒,瞬时转染COS-7,48 h后收集细胞测定荧光素酶相对表达活性。结果表明pGL3-1229质粒的相对荧光素酶活性是pGL3-1130的26%,有显著性差异。在-1 229 bp^-1 130 bp之间存在负调控元件,软件分析COUP可能是小鼠LRP5基因的负调控元件,有待进一步突变分析证实。