A型与亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒嵌合基因在家蚕杆状病毒载体中的表达

口蹄疫是一种严重危害畜牧业生产的烈性传染病。为了促进A型口蹄疫病毒(FMDV)基因工程活载体疫苗的研制,选取A型FMDV编码序列中的衣壳蛋白前体P1-2A基因中的VP1和VP3以及亚洲Ⅰ型蛋白酶3C基因,插入家蚕杆状病毒转移载体pVL1393中,构建重组载体pVL-P1-2A3C,并与线性化病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕BmN细胞,获得重组病毒Bm-P1-2A3C。将重组病毒感染家蚕5龄幼虫,以双抗体夹心ELISA法检测血淋巴中的表达产物,结果显示目的蛋白在感染病毒后108 h的蚕血淋巴中表达量最高,A型抗原表达呈阳性的最大稀释倍数为1 024,而亚洲Ⅰ型抗原表达呈阳性的最大稀释倍数为2 048。结果表明A型和亚洲Ⅰ型FMDV的P1-2A3C基因已在家蚕体内获得表达。

RNA干扰抑制口蹄疫病毒复制研究进展

鉴于现有疫苗和抗病毒药物在治疗口蹄疫方面存在的局限性,寻找新型抗病毒策略势在必行,而RNA干扰正是一种有益的尝试。RNA干扰通过沉默哺乳动物细胞中的基因表达,可有效的阻断口蹄疫病毒在宿主体内的复制。论文以口蹄疫病毒引起宿主细胞病变、RNA干扰的机制及RNA干扰抑制FMDV在宿主细胞内复制为内容,探讨如何更加有效地防控口蹄疫。

A型口蹄疫病毒VP1基因的克隆及原核表达

通过利用原核表达系统表达并纯化出A型口蹄疫病毒VP1蛋白。首先从实验室冻存的含A型口蹄疫病毒的细胞中提取FMDV总RNA,通过RT-PCR获得cDNA。并根据FMDV全基因组序列设计了一对针对VP1基因的引物,通过PCR扩增得到目的基因VP1并亚克隆入pMD 18-T载体。将鉴定出的阳性质粒和表达载体PET32a用BamHⅠ和HindⅢ双酶切回收后连接获得阳性重组质粒PET32-VP1。用IPTG诱导重组质粒表达目的蛋白VP1并用SDS-PAGE进行检测。表达产物用镍亲和树脂进行了纯化。结果证明:A型口蹄疫病毒VP1蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达且表达产物得到了纯化,为实验室进一步的研究提供了重要的材料。

A型口蹄疫病毒VP0基因的克隆及原核表达

从实验室冻存的含A型口蹄疫病毒的细胞中提取FMDV总RNA,通过RT-PCR获得cDNA。并根据FMDV全基因组序列设计了一对针对VP0基因的引物,通过PCR扩增得到目的基因VP0并亚克隆入pMD18-T载体。将鉴定出的阳性质粒和表达载体pET32a用BamHⅠ和HindⅢ双酶切回收后连接获得阳性重组质粒pET32-VP0。用IPTG诱导重组质粒表达目的蛋白VP0并用SDS-PAGE进行检测。表达产物用镍亲和树脂进行了纯化。结果证明,口蹄疫病毒VP0蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达且表达产物得到了纯化,为实验室进一步的研究提供了重要的材料。

病原体溯源技术研究进展及在寄生虫上的应用

病原体是导致人和动植物感染疾病的根源,带来一系列的安全隐患。病原体溯源研究对于基因型鉴定、分类地位准确化、流行病学调查及疾病的防控具有重大意义。近年来,分子生物学技术已被广泛用于病原溯源研究。作者主要对病原体溯源技术的最新研究进展及其在寄生虫上的应用作一综述。

抗原表位预测方法的研究进展

概述了B细胞线性表位、B细胞构象性表位、CTL表位及Th表位等抗原表位预测方法的研究进展,并对每种表位预测方法的预测结果进行了比较,旨在为从事抗原表位研究的人员提供理论参考。

牛病毒性腹泻病毒侵染细胞机制的研究进展

牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是反刍动物和猪体内广泛存在的危害动物健康的重要病原体。BVDV感染牛后主要引起牛的持续性感染、免疫耐受、免疫抑制、繁殖障碍及急慢性黏膜病等临床症状,给养牛业造成重大的损失。其致病机理非常复杂,给该病的治疗和根除带来极大的困难。随着分子病毒学研究的发展以及对猪瘟病毒和黄病毒科其他成员的研究,人们在BVDV分子水平和细胞水平的研究方面也取得了一些进展。就此,作者从BVDV入侵细胞、在细胞内的复制以及与宿主蛋白分子相互作用等方面进行综述,有助于阐明BVDV致病和在体内持续存活的机制,为该病的防治和疫苗研发提供新的思路和对策。

刚地弓形虫GJS株微线体蛋白3基因真核表达质粒的构建及在BHK-21细胞中的表达

采用PCR技术从刚地弓形虫GJS株基因组DNA中扩增微线体蛋白3(MIC3)基因,并克隆到pMD18-T载体,经PCR、酶切及测序鉴定后,阳性重组质粒酶切并亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)后进行PCR、酶切及测序鉴定。将重组质粒转染BHK-21细胞。间接免疫荧光染色证明,质粒DNA成功转染到细胞中并得以表达。Western-blot分析证实,细胞裂解液及上清样品中有1条约39.2 ku的条带,可被山羊抗刚地弓形虫超免疫血清所识别,大小与预测值相符。表明,真核表达质粒pcDNA3-MIC3中的MIC3基因在BHK-21细胞中获得表达且表达产物具有抗原性。

猪圆环病毒Ⅱ型的研究进展

猪圆环病毒Ⅱ型(porcine circovirus type2,PCV-2)是引起猪圆环病毒病(porcine circovirus desease,PCVD)的主要病原,在猪群中广泛存在。本病毒可以单独或者与其它病原混合感染猪只,引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、育肥猪皮炎与肾病综合征(PDNS)等一系列较为复杂的疾病,严重威胁猪只的健康。经过10余年持续不断的努力,各国对PCV-2的研究日益深入,对病毒的相关特性也有了较为清晰的认识。对病毒的病原学、流行病学、致病机理、临床症状、病理变化、诊断和防制对策等方面的研究进展进行了简要综述。

畜禽支原体耐药性及耐药机制研究进展

支原体感染给畜禽养殖造成的危害已受到国内外科研人员的广泛重视。目前控制畜禽支原体感染、降低畜禽养殖经济损失的切实有效方法是大量使用抗生素,其中四环素、大环内酯类及喹诺酮类药物是现阶段临床兽医首选的3类抗菌药。但短短几十年的临床实践表明,滥用抗生素已经严重威胁畜禽健康,许多畜禽支原体临床分离株不仅仅对单一抗生素产生耐药性,而且同时对多种抗生素耐药。作者从药物靶位点改变、外排泵系统形成、抗菌药物灭活酶产生等方面对上述抗畜禽支原体药物的耐药机制进行阐述,以期为建立支原体耐药性检测体系、指导临床合理用药、开发新的药物等提供理论依据和策略。

D型产气荚膜梭菌ε毒素基因表达及其免疫保护作用的初步研究

利用PCR技术,从D型产气荚膜梭菌标准株(C60-2)染色体DNA中扩增出ε毒素基因。该基因产物大小为906bp,序列分析结果表明,与GenBank报道的产气荚膜梭菌参考菌株ε毒素基因序列同源性大于99%。将扩增的ε毒素基因定向克隆到原核表达载体pET32a中,得到重组质粒pET32a-ETX,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)plys中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析可见大小为54ku的特异条带;经Western blotting和ELISA检测结果表明,表达的ε毒素能与抗天然ε毒素抗体发生特异性反应,说明ε毒素蛋白具有较好的反应原性。将表达的ε毒素蛋白用0.4%的甲醛溶液制成类毒素疫苗,免疫小鼠后,具有一定的保护力,这表明该重组菌株有望成为产气荚膜梭菌基因工程类毒素疫苗的候选菌株。

抗弓形虫药物及机理研究进展

弓形虫病（Toxoplasmosis）是一种危害十分严重的人兽共患寄生虫病,分布广泛,呈世界性分布,可在人、牛、羊、猪、鸡、猫等多种动物之间传播,给人类健康和畜牧业发展带来了严重的危害。最新血清学调查表明,全世界有30%的人群弓形虫感染呈阳性[1],我国弓形虫血清学阳性率为7.88%,其中贵州省高达16.81%[2]。

多头带绦虫TPx基因片段的克隆及原核表达

从自然感染的病羊脑内采集多头蚴原头节,提取总RNA,采用RT-PCR技术扩增多头带绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶(TmTPx)基因片段,PCR产物连接到pMD18-T载体,转化至大肠杆菌DH5α后测序,发现克隆到的TmTPx基因片段开放阅读框为453 bp,编码150个氨基酸。对TmTPx基因片段进行限制性酶切后连接到表达载体pGEX-4T-1,构建重组表达质粒pGEX-4T-TmTPx,转化大肠杆菌DH5α后筛选阳性克隆,经限制性酶切分析、PCR及测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21,以IPTG进行诱导表达,用SDS-PAGE分析表达产物。结果显示,成功表达了大小约为43 ku的融合蛋白。对表达产物纯化后免疫家兔,采集血清用ELISA测定抗体效价,发现兔抗TmTPx重组蛋白的抗体能够与多头蚴原头节抗原发生特异性反应,说明该重组蛋白具有较好的免疫原性。

猪繁殖与呼吸综合征研究进展

猪繁殖与呼吸综合征是目前养猪业中一种严重的病毒性传染病,分布广泛且对养猪业造成巨大损失。本文就病毒的病原学,病毒的基因变异,流行病学及其致病机制,临床症状及病理变化,诊断防制及疫苗研究作一综述。

多头带绦虫甘肃分离株分子COⅠ基因部分序列比较分析

应用线粒体DNA中的细胞色素c氧化酶亚基I（COI）基因作为分子标记,对我国甘肃省景泰和平凉地区10个绵羊源脑多头蚴进行分析,与已知带属绦虫种的相应序列进行相似性比较,下载GenBank数据库的带属绦虫COI基因片段序列构建系统进化树,分析其分类及亲缘关系.结果表明,所有多头带绦虫分离株均成功扩增出444 bp的COI基因片段,去除引物序列后多头带绦虫分离株的COI基因片段为396 bp,可以分为4类,共有5个核苷酸变异位点,变异率为0.25%～1.26%.基于COI核苷酸序列的系统进化树表明所有T.multiceps分离株构成一个分支,可分为2个亚群.T.multiceps与T.krabbei 的亲缘关系最近,其次为T.serialis,T.asiatica,T.saginata,与T.ovis等其他带属绦虫关系较远,与T.mustelae关系最远.COI基因序列在种内相对保守,又存在一定的种间差异,可作为带属绦虫分类鉴定研究的分子标记.

口蹄疫诊断技术的研究进展

口蹄疫是偶蹄动物的一种急性,热性,高度接触性传染病,可使世界范围内的畜牧业遭受严重的经济损失。本文综述了目前口蹄疫诊断技术的研究进展,其中包括了病毒分离技术等传统的诊断方法,以及血清学诊断方法,还介绍了环介导等温扩增技术等几种新的诊断技术。

产气荚膜梭菌青海分离株α毒素基因克隆与表达

用PCR技术,从一株田间分离的产气荚膜梭菌基因组中扩增出了1194bp的α毒素基因,经限制性核酸内切酶EcoRⅠ和NcoⅠ双酶切处理后将其连接在经同样内切酶处理的载体pET-28a(+)中的相应位点上,最后转化至受体菌BL21(DE3)中。经PCR、双酶切和核苷酸序列分析,证明重组质粒pET-28a-CPA含有产气荚膜梭菌α毒素基因,再将其转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,目的基因获得了良好表达。以羊抗α毒素多克隆血清进行Western blot分析,抗血清可与该融合蛋白发生特异性反应,表明目的蛋白具有较好的免疫原性。

弓形虫入侵宿主机制及免疫学研究进展

刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种专性细胞内寄生虫,对人类健康和畜牧业的发展造成严重危害。近年来,对弓形虫入侵宿主的机制及免疫学方面进行了大量研究,取得了许多重要的研究进展,有助于深入了解弓形虫的致病机制和进行免疫预防。本文拟从细胞与分子生物学角度阐述弓形虫入侵宿主细胞的过程,并综述宿主感染弓形虫后不同免疫细胞的作用以及不同器官的免疫应答。

刚地弓形虫代谢分泌抗原对山羊IFN-γ、TNF-α、IL-2和IL-4表达水平的影响

为了探索刚地弓形虫代谢分泌抗原(E/SA)对山羊的免疫保护机制,将山羊随机分为6组,即E/SA组、E/SA+CpG组(未乳化)、E/SA+CpG组、E/SA+IL-2组、E/SA+IL-2+CpG组、对照组,每组3只,分别于免疫前、免疫后第2周、免疫后第4周、感染后第1周及感染后第2周采集山羊血清,用ELISA法检测IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4的表达水平。结果显示,各免疫组免疫后IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4的含量分别为175.40～215.60、89.95～253.80、230.40～301.50、39.20～54.20pg/mL,而免疫前分别为14.00～18.75、30.91～42.20、10.75～18.30、20.40～24.60pg/mL,对照组分别为16.50～36.56、37.75～58.20、11.50～21.75、21.61～27.60pg/mL,免疫组在免疫后体内IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4的含量明显升高,均显著高于对照组(P<0.05)。表明,E/SA可引起IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4水平的升高,说明E/SA免疫后可引起山羊较强的细胞免疫和体液免疫应答。