斑马鱼myd88和traf6真核表达载体的构建

髓样分化因子88 (myeloid differentiation primary response gene 88, MYD88)和TNF受体相关因子6(TNF receptor associated factor 6, TRAF6)均属于Toll样受体(Toll-like receptors, TLR)家族成员中的关键衔接分子。斑马鱼是研究先天免疫应答的独特模式生物,为了构建myD88和traf6的真核表达载体,用于免疫应答机制的研究,克隆了斑马鱼myd88和traf6基因的编码区CDS全长序列,分别是855 bp和1 629 bp。结构分析表明,斑马鱼MYD88存在2个保守结构域为死亡结构域和TIR结构域,TRAF6存在4个保守结构域分别为RING结构域、2个锌指结构域、环-环(coiled-coil)结构域以及TRAF同源结构域(meprinand TRAF-homology, MATH),并与其他物种氨基酸序列一致性较高。系统进化树分析发现斑马鱼myd88和traf6基因与硬骨鱼类亲缘关系较近,说明斑马鱼myd88和traf6基因的同源性符合其在物种进化上的地位并且具有很高的结构同源性。将斑马鱼myd88和traf6基因的CDS全长序列连接至pCMV-Tag2B表达载体。通过对重组质粒进行双酶切检测发现,成功克隆了斑马鱼pCMV-myd88和pCMV-traf6真核表达载体。为了验证这2个真核表达载体的生物学功能,本研究在HEK293T细胞中进行NF-κB的报告基因活性检测。结果表明,过表达myd88和traf6基因后,斑马鱼NF-κB家族nfκb1启动子的转录活性显著升高,分别约为空载对照组的2.5倍和8倍。鉴于MYD88和TRAF6在天然免疫功能等方面的重要作用,实验结果为以后研究斑马鱼的先天免疫信号传导过程提供了有力的研究工具。

糖原贮积症Ⅴ型斑马鱼疾病模型的构建及其表型分析

建立肌型糖原磷酸化酶基因pygma和pygmb突变体斑马鱼疾病模型,对人类PYGM基因突变导致的糖原贮积症Ⅴ型(glycogen storage disease typeⅤ,GSDⅤ)的研究具有重要意义。利用CRISPR/Cas9技术成功敲除了斑马鱼pygma和pygmb基因,分别获得pygma^((-11bp)-/-)和pygma^((+14bp)-/-)两种纯合突变体,以及pygmb^((+1bp)-/-)和pygmb^((-2bp)-/-)两种纯合突变体。过碘酸希夫糖原染色(periodic acid Schiff stain)实验显示pygma^(-/-)和pygmb^(-/-)纯合突变体心脏和肌肉组织出现明显的糖原累积。对野生型斑马鱼15个早期发育时间点以及12个成鱼组织中pygma和pygmb基因表达分析显示,pygma和pygmb早期发育阶段表达模式相似,从24 hpf到125 hpf,两基因表达量总体呈上升趋势,且pygmb的上升幅度大于pygma的上升幅度。在检测的12个组织中,pygma和pygmb只在少数几个组织中有明显表达。pygma在肌肉组织中表达最高,其次为心脏和皮肤组织;pygmb在心脏、脑、眼睛3个组织中高表达,在肌肉组织中也有表达,但表达量相对较低。斑马鱼pygma^(-/-)和pygmb^(-/-)突变体具有GSDⅤ病肌肉糖原累积的典型特征,该疾病模型的建立为进一步研究糖原贮积症的发病进程、详细机制和药物筛选等治疗策略提供基础数据。

转录因子Tbx5a与Nkx2.5结合共激活nppa启动子的初步分析

心脏是脊椎动物发育过程中最早形成的重要器官之一,而先天性心脏病(先心病)是常见的先天性畸形类疾病。其中,转录因子Tbx5突变是导致先心病心手综合征的重要原因,Nkx2.5与瓣膜缺失性先心病密切相关。本研究通过启动子构建探究心脏发育重要因子tbx5a与nkx2.5对下游基因nppa的调控作用。本研究通过PCR分别克隆了斑马鱼tbx5a与nkx2.5基因的全长序列1491 bp和957 bp,成功构建了pMEV-2×HA-tbx5a和pcDNA3.1-myc-nkx2.5表达载体。同时合成了斑马鱼nppa基因2014 bp的启动子序列,并构建了荧光素酶报告基因表达载体pGL3-nppa-luc。双荧光素酶报告基因检测(Luciferase)实验结果显示,转染pGL3-nppa-luc载体的293T细胞具有较空载组6.3倍的荧光素酶活性(p<0.001),表明该2014 bp的nppa序列具备其启动子活性。本研究进一步通过与nppa启动子分别转染tbx5a、nkx2.5及两者共转染的Luciferase实验发现,斑马鱼Tbx5a和Nkx2.5可以协同作用并激活基因nppa的表达12倍(p<0.001),表明Tbx5a与Nkx2.5结合对下游nppa具备显著上调作用。本研究为进一步揭示转录因子Tbx5a与Nkx2.5对nppa的调控及其在心脏发育中的作用奠定了基础。同时,本研究成功构建具备活性的斑马鱼nppa启动子,对研究其心脏发育相关信号通路的调控机制具有重要意义。

金鱼和鲤鱼T-box基因家族成员鉴定及分析

T-box基因家族是一类重要的转录因子,广泛存在于后生动物,该家族成员在脊椎动物胚胎发育和器官形成过程中发挥重要调控作用。目前,在金鱼(Carassius auratus var.)和鲤鱼(Cyprinus carpio)中还没有对T-box基因家族进行系统的研究。本研究利用金鱼和鲤鱼基因组数据,分别鉴定出分属5个亚家族的44和47个T-box基因家族成员。最后,比较了文昌鱼、哺乳动物(人和小鼠)和硬骨鱼类(斑马鱼,金鱼和鲤鱼)之间T-box基因家族成员数目的变化。结果显示,文昌鱼T-box基因数目为11,少于哺乳动物的数目(17),约为斑马鱼数目(26)的一半;金鱼和鲤鱼T-box基因数目约为斑马鱼数目的二倍。硬骨鱼类特异的第3次全基因组复制(3R-WGD)和谱系特异(金鱼和鲤鱼祖先)的第4次全基因组复制(4R-WGD)显著增加了T-box基因家族成员的数目。本研究结果为金鱼和鲤鱼T-box基因家族的功能研究及性状改良提供了基础资料。