神经细胞特异性真核表达载体TUBA1α-EGFP的构建及鉴定

目的探讨构建具有神经细胞表达特异性的TUBA1α-EGFP真核表达载体,为进一步研究神经元细胞的发生与转化奠定基础。方法采用PCR技术克隆出长分别为1.121 kb与0.72 kb的TUBA1α启动子及EGFP基因部分序列,利用Gateway克隆技术构建pLV.EX2 d.null-TU-BA1α>EGFP质粒。最后对产生的重组子进行琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定。结果经琼脂糖凝胶电泳鉴定,所克隆的1.121 kb与0.72 kb的TU-BA1α启动子及EGFP基因片段成功地连接到pLV.Des2 d.null载体上,DNA测序证实插入到载体中的片段为目的片段。结论成功构建了神经细胞特异性真核表达载体TUBA1α-EGFP。

转染Noggin基因的骨髓基质细胞在体外分化为神经元样细胞的初步研究

目的构建Noggin基因的表达载体,初步探讨转染Noggin基因的骨髓基质细胞(BMSCs)在体外分化为神经细胞的情况。方法应用RT-PCR技术,从正常人胎脑组织中扩增出Noggin基因,利用基因工程技术构建载体pCS2+Tα1-Noggin。用Percoll分离液分离出大鼠BMSCs,借助脂质体将Noggin基因转入BMSCs。观察细胞形态的改变,并利用免疫组化鉴定分化细胞是否表达神经细胞特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白-2(MAP-2)以及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。结果成功构建Noggin基因的真核表达载体pCS2+Tα1-Noggin。Percoll分离液分离出BMSCs,转染Noggin基因表达载体后,形似神经细胞;免疫组化检测到NSE、MAP-2表达,未检测到GFAP表达。结论转染Noggin基因的BMSCs在体外可以分化为神经元样细胞。

大鼠骨髓基质细胞的分离培养

目的:建立一种体外分离、培养扩增大鼠骨髓基质细胞的方法。方法:用密度梯度离心法(Percoll法)分离出大鼠骨髓基质细胞,并用含20%(体积分数)胎牛血清的DMEM培养液培养,胰酶消化传代,倒置显微镜下观察。结果:Percoll淋巴细胞分离液分离出的大鼠单核细胞活力达99%,将细胞接种到培养瓶10～14d后,细胞长满瓶底,第1次传代,以后每5～7d传代,传3～4代,细胞形态较典型。结论:Percoll法分离出离体培养的大鼠骨髓基质细胞。