人肾小球系膜细胞原代培养方法的改进

背景:肾小球系膜细胞原代培养成功率低,生存时间短,传代次数少。其中分离提取肾小球一直是培养高纯肾小球系膜细胞的最大瓶颈。目的:建立一种操作简单、成功率高、重复性好的人肾小球系膜细胞原代培养方法。方法:取自愿水囊引产的胎儿肾,采用肾皮质组织块法合优生选择法培养人肾小球系膜细胞。相差显微镜、透射电镜观察系膜细胞形态,免疫荧光技术鉴定细胞表型,激光共聚焦显微镜观察波形蛋白的表达。结果与结论:培养的肾小球系膜细胞呈梭形/不规则星形和细长形,胞质中各种细胞器丰富,细胞突起明显,胞膜上有很多微绒毛,细胞表达α-肌动蛋白、肌球蛋白、波形蛋白、结蛋白,而不表达细胞角蛋白、Ⅷ因子,激光共聚焦显微镜下发现系膜细胞波形蛋白表达阳性并具有特征性纤维束。说明培养的系膜细胞符合肾小球系膜细胞的生物学特征。肾皮质组织块法合优生选择法是一种简单、高效的培养人肾小球系膜细胞的方法。

高糖对原代培养人肾小球系膜细胞表达MMP-9、TIMP-1的影响

目的了解高糖对原代培养的人肾小球系膜细胞表达MMP-9、TIMP-1和MMP-9/TIMP-1的影响,进一步探讨糖尿病肾病的发病机制。方法取自愿水囊引产的胎儿肾,解剖取肾皮质剪碎,应用肾皮质组织块法合优生选择法对人肾小球系膜细胞进行原代培养。ELISA方法检测MMP-9、TIMP-1的表达变化。结果与正常组相比较,高糖组MMP-9在24h、48h、72h均显著降低(P<0.01),TIMP-1在24h、72h可显著升高(P<0.05),48h表达降低;MMP-9/TIMP-1的比值在24h、48h、72h均显著降低(P<0.01)。结论高糖能够降低MMP-9/TIMP-1,与肾小球系膜细胞细胞外基质降解能力降低密切相关。

藻黄合剂防治糖尿病肾病的基础研究

目的:研究藻黄合剂防治糖尿病肾病的作用机制。方法:体外培养人肾小球系膜细胞并在高糖培养基中孵育,用不同浓度的藻黄合剂培养液孵育高糖环境下培养的GMC,于不同时间(24h、48h)采用MTS方法检测各组系膜细胞增殖的变化。分别观察24h、48h系膜细胞增殖和FN的分泌。结果:不同浓度的ZHM作用于GMC 24h、48h,除低剂量组24h无显著作用外(P>0.05),其余各组均能显著抑制GMC的增殖(P<0.01或P<0.05)。藻黄合剂各剂量组在24h、48h时均能显著抑制高糖下FN的分泌(P<0.01或P<0.05)。结论:ZHM在一定时间内可明显抑制体外培养的GMC在高糖环境下的增殖,同时抑制FN的分泌,这可能是藻黄合剂延缓糖尿病肾病、保护肾功能的作用机制之一。

重组人血管内皮抑制素冻干粉针剂的研制和质量评价

目的研究重组人血管内皮抑制素(endostar)冻干粉针剂的制备和质量控制。方法以4%甘露醇、2%蔗糖、30mm乙酸钠为辅料,将endostar制备成冻干粉针剂。分别采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)和高效液相法(HPLC)分析冻干粉的纯度,使用人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)分析冻干粉的活性,其他检测项目按照《中国药典》进行。结果 Endostar冻干粉的纯度大于99%,生物学活性每支含量2.4×105U,等电点主区带在8.8～9.8之间,冻干粉用胰蛋白酶消化后,肽图与理化对照品一致。结论按照此工艺制备的endostar冻干粉针剂各项指标均符合《中国药典》要求。

人血管抑素Kringles 1-3的表达纯化及生物学活性研究

人血管抑素包含了4个环饼状结构域(Kringle),是一个有效的血管生成抑制因子。采用PCR方法从人胚肝cDNA文库中扩增了人血管抑素Kringles1-3的基因,重组于pPIC9K载体中,获得重组载体pPIC9K-K1-3,然后转化毕赤酵母细胞GS115,获得重组菌株。K1-3蛋白在5 L发酵罐的表达量达41.2 mg/L,发酵液上清经过浓缩、透析,然后用Lysine Sepharose 4B层析柱纯化,得到的K1-3蛋白纯度大于98%,纯化回收率达到95%以上。K1-3能明显抑制bFGF刺激的人微血管内皮细胞的迁移,达到抑制效果为50%时所需的蛋白浓度(IC50)为1.86μg/ml。K1-3也能抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管的生长,抑制率达95%。为应用人血管抑素Kringles1-3治疗肿瘤奠定了初步实验基础。