山东规模化养殖场毛皮动物多重感染病原学分析

2012—2013年间,山东10个地市多家毛皮动物养殖场养殖的毛皮动物(狐狸、貉子、水貂)出现腹泻,皮肤湿疹,神经症状,空怀、流产、出血性肺炎等症状和病变类似的疫情,为探明其病因,本研究对发病规模化毛皮动物养殖场发病情况进行调查,并对送检的病料进行病原学检查,结果发现,犬瘟热病毒、细小病毒、阿留申病毒感染率分别为54.21%、47.30%、31.35%;肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌、肺炎双球菌、大肠杆菌、沙门杆菌、绿脓杆菌、加德纳菌的感染率分别为37.58%、25.05%、21.81%、14.04%、12.53%、10.37%、8.21%;犬瘟热病毒、细小病毒、阿留申病毒、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌、肺炎双球菌6种病原的单独感染、二重感染、三重感染、四重感染分别为22.03%、39.52%、36.07%、2.38%,未见五重以上的感染。结果表明,近两年造成山东规模化场毛皮动物发病主要原因是由犬瘟热病毒、细小病毒、阿留申病毒与肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌、肺炎双球菌多重感染所致,这为规模化毛皮动物养殖场有效地控制疫病提供了理论依据。

毛皮动物肺炎克雷伯菌Ⅲ型菌毛A基因克隆测序与生物信息分析

根据GenBank中肺炎克雷伯菌Ⅲ型菌毛结构基因A(MrkA)JF759921的序列设计1对引物,对8株毛皮动物肺炎克雷伯菌进行克隆测序,并应用生物信息学相关软件和方法,预测MrkA蛋白二级结构和B细胞抗原表位。PCR扩增出了609bp的目的基因片段,生物信息分析结果显示其开放阅读框架为609bp,编码202个氨基酸;二级结构以无规卷曲为主,有少量的α-螺旋和β-片层,少见β-转角,推测MrkA蛋白有8个B细胞优势抗原表位区域。结果表明,MrkA基因较稳定,其在进化过程中并未发生明显变异,为进一步分析肺炎克雷伯菌免疫机理、制备单克隆抗体和设计表位疫苗等奠定理论基础。

山东省2010-2016年畜间和人间布鲁菌病疫情分析

应用Excel 2013软件对山东省2010-2016年的布鲁菌病档案和疫情报告以及山东省卫生和计划生育委员会公告数据进行统计描述性分析。结果显示,除2013年以外,山东省畜间布鲁菌病和人间布鲁菌病的走势一致,且2015年和2016年的畜间布鲁菌病和人间布鲁菌病的增幅都有所放缓。男女的发病比例为2.6∶1,不同年龄组中,40～50岁年龄组的人间布鲁菌病新发病例数占人间布鲁菌病新发病例总数的17.8%,且发病人群以农民为主,其次是牧民。感染布鲁菌病的家畜是人间布鲁菌病的主要传染源,人患布鲁菌病取决于与牲畜等传染源密切接触的程度,控制和根除畜间布鲁菌病能有效降低人间布鲁菌病的发病率。山东省畜间和人间布鲁菌病的情况依然严峻,应加强山东省畜间和人间布鲁菌病的疫情监测,密切关注疫情流行动态。

山羊鲍曼不动杆菌分离鉴定和病原性研究

为鉴定2013年初造成山东潍坊某羊场羊群发病的病原,本研究从患病山羊器官中分离到2株致病细菌,对分离的菌株经形态特征、生化试验及致病性试验进行鉴定,并通过分离菌株16S rRNA基因序列比较和系统发育分析。鉴定结果表明分离株为鲍曼不动杆菌;此外,16S rRNA基因同源性比对分析显示2株分离菌株核苷酸序列之间同源性为100%,与参考菌株NC009085株(人源)鲍曼不动杆菌标准菌株核苷酸序列同源性为100%,与绵羊源、牛源、鹅源鲍曼不动杆菌参考菌株核苷酸序列同源性分别为100%,99.9%,99.9%;耐药性结果显示其仅对舒巴坦和强力霉素敏感,致病性试验结果显示其对小鼠具有较强的致病作用。该分离株与人源、绵羊源、牛源和鹅源鲍曼不动杆菌的亲缘关系较近,可能为人畜共患病病原菌。

山东地区羊绿脓杆菌的分离鉴定及系统发育分析

近年,山东省规模化羊场羊患慢性化脓性肺炎病例频繁出现,为了探明其病原及特点,本试验在流行病学调查基础上,对山东省6个地区10个规模化羊场的病、死羊进行临床症状观察、病理学检查,对所分离的菌株进行形态特征、理化特性检查及药敏试验、致病性试验和16SrRNA基因的分子鉴定。结果显示,从剖检病死羊的肺、肝、气管等组织中分离出6株细菌(分别命名为PA1~PA6),分离菌株镜检均为革兰阴性、短杆菌,对庆大霉素高度敏感,对小鼠具有较强致病作用。综合流行病学和生化试验结果等判定,该6株分离菌均为绿脓杆菌。对6株绿脓杆菌16SrRNA序列分析表明,该6株分离菌与已知的绿脓杆菌16SrRNA序列的同源性为99.9%~100%,与报道的绿脓杆菌菌株B136-33、YMD-4以及LCQ-4的序列位于一个分支上,属于一个亚群,其中与北京株B136-33的进化关系更近,核苷酸同源性为100%。

芦荟粗提物抑菌及抗病毒作用的研究

为研究芦荟粗提物对多种常见畜禽致病菌和病毒的体外抑菌和抗病毒作用,本实验采用培养基打孔法观察芦荟粗提物对致病菌的抑菌作用;采用含不同浓度芦荟粗提物的固体培养基培养致病菌观察其抑菌效果;采用细菌计数法分析致病菌在芦荟粗提物液体培养基中的增殖情况。分别采用细胞培养和鸡胚接种法检测不同浓度芦荟粗提物以及不同作用时间对传染性囊病病毒(IBDV)和新城疫病毒(NDV)增殖的抑制作用。结果表明:芦荟粗提物对供试菌均具有抑菌作用,其中金黄色葡萄球菌、四联球菌、八叠球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、蜡样芽胞杆菌培养时出现明显的抑菌圈,直径(D)>14 mm;固体培养基中芦荟粗提物浓度大于40%时可形成可明显地减少菌落数;浓度大于80%的液体培养基中细菌生长到达对数期的时间比对照组延长至少4 h。IBDV与芦荟粗提物作用组的MTT OD570nm值均高于病毒对照组,并且随浓度的增大和时间的延长而升高;NDV与芦荟粗提物作用组的血凝价均低于病毒对照组,并且随浓度的增大和作用时间的延长而降低。

泰山松花粉多糖对PRRSV GP5亚单位疫苗免疫增强作用的研究

为研究泰山松花粉对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5的免疫增强作用,本研究以原核表达的高致病性PRRSV GP5蛋白为抗原,添加不同剂量的天然提取的泰山松花粉多糖(TPPPS)作为免疫佐剂配制PRRSV亚单位疫苗。选取72只SPF昆明小鼠随机分为6组(Ⅰ-Ⅵ),12只/组。Ⅰ组免疫纯化的GP5亚单位疫苗,Ⅱ-Ⅳ组分别免疫不同浓度的TPPPS(20 mg/mL、40 mg/mL、60 mg/mL)佐剂GP5亚单位疫苗,V组免疫弗氏不完全佐剂GP5亚单位疫苗,VI组注射PBS;1周后各组均加强免疫1次,加强免疫后,每周每组随机挑选3只小鼠采集外周血,分别检测小鼠血清抗体效价、T淋巴细胞亚群比例、T淋巴细胞转化率和细胞因子的含量,评价TPPPS对PRRSV-GP5蛋白诱导的免疫应答反应的调节作用。结果显示,所有疫苗免疫组小鼠的上述免疫指标比对照组均有显著提高,而添加TPPPS和弗氏佐剂的疫苗组各项指标均显著高于单独GP5蛋白免疫组。3个浓度的TPPPS佐剂中,60 mg/mL浓度的免疫增强效果最显著。本研究表明,重组表达的PRRSV GP5蛋白能够诱导动物机体显著的免疫应答,TPPPS佐剂对PRRSV GP5蛋白呈现显著的免疫增强效果。本研究为研制PRRSV亚单位疫苗提供了参考。

产气荚膜梭菌β毒素蛋白抗原表位预测及CPB-N蛋白免疫原性分析

为获得具有与β毒素蛋白相同免疫原性的新蛋白,本研究对产气荚膜梭菌β毒素蛋白的氨基酸序列进行综合分析,预测其抗原表位并筛选出有效的新蛋白。采用生物信息学方法综合分析β毒素蛋白二级结构、亲水性、可塑性、抗原性、跨膜区域以及信号肽,同时参考ElliPro服务器在线预测。最终预测aa108～aa320区段为优势抗原表位,在此基础上建立β毒素蛋白三维结构模型,标记特殊位点并筛选出B型产气荚膜梭菌新蛋白(CPB-N)。诱导表达CPB-N后通过SDS-PAGE和western blot鉴定,结果显示在约24 ku处有明显条带。采用间接ELISA方法对免疫小鼠的血清和肠道灌洗液样品进行检测,结果表明CPB-N与β毒素蛋白的免疫原性基本相同。CPB-N蛋白的筛选及预防产气荚膜梭菌引起的疾病奠定了重要的研究基础。

致羔羊腹泻奇异变形杆菌的分离鉴定及迁徙行为分析

2015年春,山东滕州某规模化羊场新生羔羊出现严重的腹泻,并且部分羔羊死亡。对该羊场病死羔羊进行剖检后,共分离到4株细菌(分别命名为PM1、PM2、PM3、PM4)。对所分离的细菌进行形态特征、生化试验以及16S rDNA遗传分析,判定该4株菌均为奇异变形杆菌。16SrDNA系统发育及同源性分析显示:4株分离菌与其他11株奇异变形杆菌的同源性为99%以上,其中与中国Hu株、马来西亚PPB3株以及印度BAB-199株位于同一个分支上,且与中国的Hu株的进化关系最近;4株分离菌之间的同源性为100%,判断为同1株菌。细菌生长曲线、药敏试验、毒力试验、毒素测定试验以及游散行为分析结果表明,该分离菌于14h左右达到生长稳定期,且对环丙沙星、左氟沙星最为敏感;对小鼠有强致病性,分离菌培养液的无菌滤液对小鼠无毒性作用;在含0.5%琼脂的LB平板上迁徙速度最快,且在含琼脂1.5%和2.0%的LB平板上呈圆环样周期运动。该研究结果为羊奇异变形杆菌病的防控提供了基础。

ALV-J不同接种途径诱导SPF鸡免疫抑制状况的比较分析

将1日龄SPF鸡分别通过口服、点眼、腹腔注射、肌肉注射的方式感染J亚群禽白血病病毒(subgroup J avian leucosis virus,ALV-J),监测各感染组鸡的生长性能、带毒和排毒规律,并对其病毒血症、相关免疫学指标及抗体反应进行动态检测。结果显示:各感染组鸡的生长性能和免疫应答水平存在明显差异。从感染后第2周开始腹腔注射和肌肉注射组可检出泄殖腔排毒和病毒血症,此后持续带毒、排毒;体质量、免疫器官指数以及淋巴细胞转化率、CD4+和CD8+T淋巴细胞数、细胞因子(IL-2、IL-4和IFN-γ)的分泌量显著低于对照组;抗体转阳不明显。而口服、点眼感染组与对照组相比引起的免疫抑制程度并不显著。结果表明:1日龄雏鸡感染ALV-J容易造成免疫抑制,其中腹腔注射和肌肉注射感染造成鸡体带毒、排毒和免疫抑制的能力最强。本试验明确了鸡群ALV-J水平传播的不同途径与鸡的感染力、免疫抑制力之间的关系,为研究ALV-J的感染机制、种群净化以及防控提供了理论依据。

济宁青山羊生后乳腺GHR和IGF-ⅠR的分布及其mRNA表达的发育性变化

采用SABC法检测济宁青山羊生后发育过程中生长激素受体(growth hormone receptor,GHR)与胰岛素样生长因子Ⅰ受体(insulin like growth factorⅠreceptor,IGF-ⅠR)在乳腺组织中的分布;GAPDH作为内参基因,qRT-PCR法检测GHR mRNA与IGF-ⅠR mRNA相对表达量。结果显示:GHR和IGF-ⅠR阳性物质主要在乳腺组织内的导管上皮细胞、基质细胞和血管内皮细胞的胞质中表达,细胞核偶有表达;GHR和IGF-ⅠR阳性细胞光密度值与其mRNA表达趋势基本一致,但IGF-ⅠR的表达量低于GHR;GHR和IGF-ⅠR在出生当天表达水平较低,60日龄(初情期)和120日龄(性成熟)出现峰值(P<0.05),120日龄后逐渐下降。结果表明:济宁青山羊生后发育时期,GHR与IGF-ⅠR对乳腺的生长发育具有重要的调节作用,初情期和性成熟期可能是乳腺生长发育最快的阶段。

梭状芽孢杆菌对DON处理生长猪肠道屏障和菌群区系的影响

旨在研究添加梭状芽孢杆菌(Clostridium)对脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)处理生长猪肠道屏障和菌群区系的影响,为DON生物解霉的研究提供基础。选取了24头4月龄,平均体质量为(55.58±1.83)kg的健康PIC父母代生长猪,随机分为3组,每组8个重复,每个重复1头。分别饲喂基础日粮(对照组)、5 mg/kg DON污染日粮(DON组)、添加Clostridium菌液(15 mL·kg^-1·d^-1)的污染日粮(DON+C组)。预饲期7 d,正试期28 d。电镜扫描结果显示,DON能引起生长猪肠道屏障,特别是回肠绒毛的严重损伤,添加Clostridium后,肠道损伤减弱;16S rRNA结果表明,DON能导致回肠菌群区系的显著变化,而添加Clostridium后,其能在猪后段肠段中定植,维持肠道菌群的相对稳定。结果表明,Clostridium能够保护DON处理猪的肠道屏障及菌群结构。