小麦黄花叶病毒(WYMV)2个山东分离物的全基因组序列及进化分析

利用5'RACE结合一步法RT-PCR分别从山东泰安与临沂冬小麦上克隆了小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus,WYMV)的全基因组序列。这2个分离物(TADWK和LYJN)基因组间核苷酸一致性分别为97.21%(RNA1)和95.12%(RNA2)。通过对目前已报道的共14个分离物的基因组不同部分的分析,表明5'UTR是WYMV基因组变化幅度最大的区域,而编码区(ORF)及3'UTR的序列一致性较高且变动幅度小。另外,发现LYJN RNA2的5'UTR与已报道的所有分离物RNA2的核苷酸一致率仅为90%左右。综合分析RNA1和RNA2的系统发生树,表明WYMV各基因组片段呈单独进化特征,不同分离物间存在RNA重排。RNA重组分析显示在LYJN RNA1和TADWK RNA2发现了RNA重组。此研究说明WYMV在山东地区存在分离物分化现象,WYMV的5'UTR是基因组中的突变热点。

烟草丛顶病毒RNA依赖RNA聚合酶(RdRp)介导的体外复制体系

通过重叠PCR扩增得到烟草丛顶病毒(Tobacco bushy top virus,TBTV)中国分离物RdRp的编码序列,构建以pMALC2X为基础载体的原核表达载体pMAL-TB-RdRp。0.5 mM IPTG诱导可特异性表达分子量约为120 kDa的MBP-RdRp融合蛋白。温度梯度实验显示,18℃下诱导表达的MBP-RdRp融合蛋白的可溶性比例较高,约17%;经亲和层析纯化的MBPRdRp可特异性识别TBTV正链和负链的3'末端序列,催化体外复制;对正负链的3'末端的体外复制效率存在差别,识别负链3'末端的体外复制效率明显高于正链3'末端。本研究创建的TBTV RdRp介导的体外复制体系为进一步研究TBTV基因组复制调控奠定了基础。

小麦黄花叶病毒Nib蛋白介导的体外转录体系的创建

本研究是利用异源表达的小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus,WYMV)复制酶Nib蛋白创建了病毒核酸的体外复制系统。将WYMV的Nib编码序列扩增并插入到大肠杆菌表达载体p MAL-C2X中以构建原核表达质粒p MAL-WYNib。0.4 mmol·L^(-1)IPTG诱导可特异性表达分子量约为100 k Da的M BP-Nib融合蛋白。根据温度梯度测定,20℃下诱导M BP-Nib的可溶性比例较高,约为30%,可满足M BP标签的亲和层析。通过与WYM V的其他蛋白和烟草丛顶病毒的RdRp进行比较,纯化的M BP-Nib融合蛋白可以特异性识别WYM V RNA1和RNA2的3'末端区域并体外合成其互补链,此体外转录体系可用于WYMV复制调控的研究。

对小麦黄花叶病毒存在抗性差异的2种小麦品种中eIF4E序列分析

小麦黄花叶病于1927年在日本首次报道,其病原包括小麦黄花叶病毒（Wheat yellow mosaic virus,WYMV）和中国小麦花叶病毒（Chinese wheat mosaic virus,CWMV）。我国各省麦区在1980年以后陆续报道了其发生与危害,对小麦生长发育构成严重影响。

水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)S3和S10基因组非编码区对翻译的调控作用

水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)基因组含有5’帽子,无3’poly(A)尾巴,且不同基因组片段的5’和3’末端序列均十分保守。本研究以RBSDV S3和S10为对象,分析其非编码区对翻译的调控作用。研究发现S3和S10的5’UTR在有无帽子时均可以正向调控报告基因Fluc的翻译,具备核糖体内部进入位点(IRES)活性,且5’末端的基因组保守序列及邻近序列与IRES活性密切相关;而对应的3’UTR则抑制5’UTR对翻译的正调控效应,其分子基础是5’UTR和3’UTR之间的RNA-RNA互作,且该互作也抑制帽子依赖型翻译的效率。这是首次关于有帽子植物RNA病毒中IRES元件的报道,研究结果对了解植物双链RNA病毒基因组非编码区对翻译的调控作用具有重要科学意义。