嗜热毛壳菌外切葡聚糖纤维二糖水解酶的纯化和部分性质研究

研究液体发酵嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)产生的一种外切葡聚糖纤维二糖水解酶的分离纯化及特性。粗酶液经硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析、Sephacryl S-100分子筛层析、Q Sepharose Fast Flow强阴离子层析等步骤后获得凝胶电泳均一的外切葡聚糖纤维二糖水解酶。经12.5%SDS-PAGE和凝胶过滤层析方法测得该酶的分子量大小约为66.3kDa和67.1kDa。该酶反应的最适温度和pH值分别为65℃和5.0。在60℃以下酶比较稳定,在70℃酶的半衰期为1h,在80℃下保温20min仍具有20%的活性,该酶的热稳定性较中温真菌的同类酶高,与国外报道的嗜热真菌的同类酶热稳定性接近。以pNPC为底物的Km值为0.956mmol/L。

嗜热子囊菌光孢变种β-葡萄糖苷酶的基因克隆、表达及酶学性质分析

从嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascus aurantiacus var.levisporus)RNA中通过RT-PCR克隆出β-葡萄糖苷酶基因bglⅠ的全长序列,cDNA序列为2672bp,Genbank登录号为EU269025,将该片段插入巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris分泌型表达载体pPIC9K中,获得重组质粒pPIC9K/bgl,经线性化后用电穿孔法导入毕赤酵母GS115中,在醇氧化酶AOX1基因启动子作用下,获得高效表达β-葡萄糖苷酶的毕赤酵母工程菌株.经DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析纯化了该重组表达蛋白.SDS-PAGE测得该重组蛋白相对分子质量(Mr)约为120×103.经甲醇诱导,培养基中β-葡萄糖苷酶的活力可达1.2U/mg,小规模发酵量达0.45mg/mL.该酶的最适反应温度为60℃,最适反应pH为5.0.于70℃保温30min仍保持80%的酶活力,具有较高的热稳定性,在pH3.0～9.0的条件下酸碱耐受性强.

嗜热酶的稳定性及其应用前景

高温条件下,嗜热酶能保持热稳定性,发挥生物催化作用。介绍了嗜热酶的稳定性机理及其应用前景。

嗜热真菌热稳定性β-葡萄糖苷酶的克隆表达、纯化及酶学性质

从嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascus aurantiacus var.levisporus)中克隆出β-葡萄糖苷酶基因bglII的全长序列,GenBank注册号为EU263992。将该基因插入巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris分泌型表达载体pPIC9K中以获得重组质粒,将重组质粒转导入毕赤酵母中,大量筛选后获得高效表达β-葡萄糖苷酶的酵母工程菌株。经甲醇诱导6d,培养基中β-葡萄糖苷酶的活力可达0.23U/mg。该酶的最适反应pH为5.0,最适反应温度为50℃。通过DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析纯化了该重组蛋白质。SDS-PAGE测得该重组蛋白质分子量约为118kDa。

嗜热子囊菌原变种Thermoascus aurantiacus var.aurantiacus热稳定几丁质酶的克隆表达及活性研究

研究通过RT-PCR和Tail-PCR技术从嗜热子囊菌原变种Thermoascus aurantiacus var.aurantiacus中克隆了一个几丁质酶同源基因。该基因全长1,253bp,包含一个由1,197个碱基构成的开放阅读框,编码398个氨基酸。序列比对分析表明,该基因编码蛋白属于糖苷水解酶18家族的几丁质酶。利用基因重组的方法构建酵母分泌型表达载体,并转化毕赤酵母。在甲醇的诱导下,重组蛋白得到了高效表达,第6天的表达量最高,达到0.433g/L,酶活力为28.96U/mg,同时对表达的几丁质酶进行了纯化,SDS-PAGE检测该蛋白的分子量为43.9kDa。该几丁质酶的最适反应温度为60℃,最适反应pH值为8.0,70℃处理30min仍有45%的相对酶活,具有较好的热稳定性及工业应用价值。