反义硫代寡核苷酸抗乙肝病毒作用机理的探讨

为了探讨反义寡核苷酸（ＡＳＯＮ）进行抗乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）基因治疗的可行性及ＡＳＯＮ抗ＨＢＶ作用机理，设计合成了针对ＨＢＶ不同基因位点的ＡＳＯＮ〔ＰｒｅＳ２翻译起始位点、ＨＢＶ调节成份顺向重复序列（ＤＲ２）和增强子Ⅱ〕。以ＨｅｐＧ２·２·１５细胞为细胞模型，动态观察了这三种ＡＳＯＮ不同浓度不同时间的抗ＨＢＶ作用。结果表明：这三种ＡＳＯＮ对ＨＢｅＡｇ的抑制率分别为９１．１％、４４９％和５６４％，对ＨＢｓＡｇ的抑制率分别为６５７％、６０１％和５１５％，无关序列无明显抑制作用。应用反义寡核苷酸技术，为研制新一代抗ＨＢＶ基因治疗药物奠定了基础，探讨了特异性阻断ＨＢＶ基因表达的可能途径。

p16在肝细胞癌组织内变异的研究

应用分子杂交及免疫组化方法检测５６例ＨＣＣ组织内的抑癌基因ｐ１６。结果显示，ＨＣＣ标本中ｐ１６蛋白在癌细胞内表达的阳性率为３７５％（２１／５６），而ｐ１６ＤＮＡ斑点杂交的阳性率为５５３６％（３１／５６）。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ转膜杂交证实，１２５％（７／５６）ＨＣＣ标本存在ｐ１６的甲基化变异，４４６４％（２５／５６）ｐ１６基因缺失。提示ＨＣＣ发生。

人乳头瘤病毒HPV16L1-E7C重组腺病毒载体的构建

采用ＰＣＲ方法，从ＨＰＶ１６型野毒株质粒中分离出ＨＰＶ１６Ｌ１（５５５９７１５１ｂｐ）、ＨＰＶ１６Ｅ７Ｃ（６８２８５５ｂｐ）基因片段，采用ＰＣＲ产物的ＴＡ克隆法，将Ｌ１、Ｅ７Ｃ分别插入ｐＧＥＭＴＥａｓｙ载体，构建克隆载体ｐＴＡＬ１、ｐＴＡＥ７Ｃ。ＢａｍＨⅠ、ＨｉｎｄⅢ酶切ｐＴＡＥ７Ｃ，Ｂｇ１Ⅱ、ＣｌａⅠ酶切ｐＴＡＬ１，回收Ｌ１、Ｅ７Ｃ片段，利用ＢａｍＨⅠ、Ｂｇ１Ⅱ酶切产生相同粘末端的特点，产生Ｌ１Ｅ７Ｃ重组基因片段，将其克隆入质粒ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔｓｋ，构建了ｐＢＳＬ１Ｅ７Ｃ重组克隆质粒，ＨｉｎｄⅢ、ＸｈｏⅠ酶切ｐＢＳＬ１Ｅ７Ｃ，释放Ｌ１Ｅ７Ｃ基因片段，定向重组入ｐＣＡ１４腺病毒载体，成功构建真核表达载体ＨＰＶ１６Ｌ１Ｅ７Ｃ重组腺病毒载体：ｐＣＡ１４Ｌ１Ｅ７Ｃ。