银椴苷抑制人胰腺癌细胞增殖的作用及机制研究

目的研究银椴苷抑制人胰腺癌细胞增殖的作用,并初步探讨其可能作用机制。方法利用MTT和细胞克隆形成实验,检测银椴苷对人胰腺癌PANC-1细胞增殖的作用;利用流式细胞术检测银椴苷对PANC-1细胞周期的影响;RT-PCR检测PANC-1细胞中羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG-CoA reductase,HMGCR)和低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor,LDLR)在基因水平的表达;Western blot检测HMGCR、LDLR、细胞周期素依赖蛋白激酶1(cylin-dependent protein kinase 1,CDK1)及细胞周期蛋白B1(Cyclin B1)在蛋白水平的表达。结果银椴苷可浓度和时间依赖性地抑制PANC-1细胞增殖,在25μmol·L^(-1)时能使细胞周期阻滞在G_2/M期,且呈浓度依赖性;与对照组相比,银椴苷(25、50、100μmol·L^(-1))能降低胆固醇合成限速酶HMGCR、胆固醇吸收关键蛋白LDLR、Cyclin B1、CDK1的表达。结论银椴苷可抑制胰腺癌PANC-1细胞的增殖,并伴随着G_2/M期周期阻滞,其机制可能与银椴苷抑制CDK1、Cyclin B1、HMGCR和LDLR表达相关。

陶瓷羟基磷灰石去除单抗聚集体的工艺研究

目的研究陶瓷羟基磷灰石(ceramic hydroxyapatite,CHT)I型和II型对2种单克隆抗体(monoclonal Ab,m Ab)1和2聚集体的去除工艺。方法层析仪为AKTA AVANT 150,层析柱为Tricon 10/50,先进行CHT I、CHT II 2种填料的动态载样量研究,然后选取合适的载量进行分离纯化研究。上样条件为5 mmol/L磷酸二氢钠(Na H2PO4),p H 6.5,上样,然后用10 mmol/L Na H2PO4,p H6.5和10 mmol/L Na H2PO4,2 mol/L Na Cl,p H 6.5梯度洗脱来分离单体和聚集体。用分子尺寸排阻高效液相色谱(SEC-HPLC)测定上样蛋白溶液和洗脱峰单体及聚集体的含量。使用20 cm高的XK 16/40的层析柱进行工艺放大研究。结果 m Ab 1在CHT I型的载量为40 mg/m L,去除后单体含量为98.6%,工艺收率为92.5%;m Ab 2在CHT I型的载量为45 mg/m L,去除后单体含量为98.8%,工艺收率为91.5%;m Ab 1在CHT II型载量为16 mg/m L,去除后单体含量为99.8%,工艺收率为91.8%;m Ab 2在CHT II型载量为20 mg/m L,去除后单体含量为99.9%,工艺回收率为92.2%。结论 2种类型的陶瓷羟基磷灰石填料在聚集体含量高于10%的情况下,都有很好的去除能力,去除结果符合法规要求。该方法操作简单,能够很顺利的进行工艺放大,满足中试和生产需求。

建立高效液相色谱法指纹图谱分析方法评价五味子药材质量

目的:建立高效液相色谱法(HPLC)指纹图谱方法评价五味子药材质量,指认其中13 种木脂素成分,建立指纹图谱共有模式,评价五味子药材质量。方法:使用Luna C18 色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流动相为水(A)-乙腈(B),梯度条件为:0~20 min,55%A→35%A;20~26 min,35%A;26~50 min,35%A→25%A。检测波长为220 nm。采用HPLC指纹图谱分析14批五味子药材。通过SPSS系统聚类分析,将五味子药材划分为两类,Ⅰ类为推荐品,Ⅱ类为一般品。取Ⅰ类推荐品药材建立共有模式,采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”处理软件,计算各批药材与共有模式间的相似度,规定相似度在0.90以上的五味子药材为推荐品。结果:结果表明,除9号产地药材外均为推荐品。结论:该HPLC指纹图谱方法可用于评价五味子药材质量。

GMP在无菌药品生产质量管理中细节问题的应用与分析探讨

基于现代化发展的大背景之下,我国经济发展迅速,人们的物质生活水平逐渐提高,对于健康的关注程度也越来越高,尤其是对无菌药品的要求也越来越高。随着产品生产质量管理规范(GMP)在各个行业中普及和推广,有关无菌药品生产的企业也逐渐开始加强对药品安全生产管理的重视程度并开始强制性执行,通过实施GMP,企业可以有效的增强自身的生产水平,提高在市场中的核心竞争力。

基于血管紧张素转换酶2受体表达的SARS-CoV-2假病毒中和活性检测方法的建立及验证

目的建立基于血管紧张素转换酶2(angiotensin converting enzyme 2,ACE2)受体表达的严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)假病毒中和活性检测方法,并进行验证。方法采用流式细胞术和qPCR法分别检测Huh-7及HEK293T-hACE2细胞中ACE2受体蛋白表达和ACE2受体基因mRNA转录水平。选择ACE2受体蛋白表达及mRNA转录水平较高的细胞建立SARS-CoV-2假病毒中和活性检测方法,并优化病毒滴度、细胞浓度及抗体浓度。验证方法的准确性、线性范围、精密性及专属性。评价建立方法对假病毒拉姆达及德尔塔变异株的适用性。结果HEK293T-hACE2细胞中ACE2受体蛋白表达和ACE2受体基因mRNA转录水平远高于Huh-7细胞,因此采用HEK293T-h ACE2细胞建立SARS-CoV-2假病毒中和活性检测方法。最佳病毒滴度为2.6×104TCID50/mL,细胞浓度为4×1054个/mL,抗体浓度为100 nmol/L。150%、130%、100%、70%、50%5个相对活性浓度的SARS-CoV-2抗体参考品(简称参考品)的回收率在80%~120%范围内;参考品在50%~150%相对活性浓度范围内实际检测值与理论值呈良好线性关系,线性方程为:Y=1.061 X-7.72,R=0.9472;精密性验证CV均<10%;参考品的相对活性浓度与抑制率可拟合成四参数拟合曲线,重组抗RANKL人源化全单克隆抗体及制剂缓冲液均未显示曲线。假病毒拉姆达和德尔塔变异株的假病毒中和活性检测结果均可获得拟合曲线。结论建立的基于ACE2受体表达的SARS-CoV-2假病毒中和活性检测方法具有良好的准确度、精密性、线性及专属性,有望应用于SARS-CoV-2抗体类药物早期筛选及研发过程中质量的控制。