HIV相关脑病患者中枢神经系统来源的HIV-1Tat蛋白对HUVECs活性的影响

目的在原核细胞中表达并纯化HIV相关脑病(HIV-associated dementia,HAD)患者基底核(basal ganglia,BG)来源HIV-1Tat蛋白,研究其对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)活性的影响。方法以本室保存的重组质粒pGEX-KG-tat为模板扩增tat,构建重组表达载体pET-32a-tat。转化BL21(DE3)并用IPTG诱导表达Tat蛋白。Tat蛋白经镍亲和层析柱和凝胶过滤预装柱纯化、SDS-PAGE和Western blot(WB)鉴定后浓缩,测定BCA蛋白浓度,cck-8检测不同浓度Tat对HUVECs活性的影响。结果在BL21大肠杆菌中表达、纯化得到了纯度较高的Tat蛋白,BCA测定浓度为0.47mg/ml。随着Tat浓度的增加,HUVECs活性逐渐降低,与阴性对照组相比,100ng/ml、200ng/ml两组细胞活性差异均无统计学意义(P>0.05),300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml四组细胞活性差异均有统计学意义(P<0.05),但四组组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论在原核细胞中高效表达了具有生物学活性的HIV-1Tat蛋白,浓度达到300ng/ml可显著降低HUVECs的活性。

HIV-1 Tat蛋白对脑组织中血管内皮细胞和神经细胞氧化应激影响的研究进展

HIV-1可穿过血脑屏障,感染中枢神经系统,引起一系列神经系统疾病。氧化应激(oxidative stress,OS)在不同的神经退行性疾病的发病机制中具有重要作用。当机体遭受各种有害刺激时,体内氧化系统和抗氧化系统的调控水平失衡,产生大量活性氧(reactive oxygen species,ROS),从而直接或间接导致组织损伤。HIV-1感染细胞后释放的反式转录激活因子Tat蛋白对于脑组织的损伤具有重要作用,它可诱导血管内皮细胞和神经细胞产生ROS,使机体处于慢性氧化应激状态,加重疾病的发展。本文就HIV-1 Tat蛋白对血管内皮细胞和神经细胞氧化应激影响的研究进展进行综述。

HAD患者来源的HIV-1 Nef蛋白对U87细胞分泌TNF-α和IL-1β细胞因子的影响

目的探讨HIV-1负调控因子(Nef)在HIV-1神经致病性中的作用。方法从HIV-1相关痴呆(HIV-associated dementia,HAD)患者的中枢神经系统(central nervous system,CNS)和外周5个部位(基底结、额叶皮质、脑膜、颞叶皮质和脾)中获得5株不同的HIV-1 nef基因,与载体pcDNA3.1连接构建重组的pcDNA3.1-nef真核表达载体,转染人神经胶质瘤细胞U87。转染后22 h、27 h、32 h、37 h和42 h经免疫组化法和Western blot检测Nef蛋白表达情况,采用JEDA801D和JD-801软件对结果进行半定量分析。转染后27 h~62 h,每间隔5 h收集U87细胞的培养上清,ELISA测定上清中两种细胞因子TNF-α和IL-1β的含量,分析两种细胞因子的动态表达情况。结果成功构建5株来自一例HAD患者不同部位组织的nef基因的重组的pcDNA3.1-nef真核表达载体,转染U87细胞。免疫组化实验的结果显示,Nef蛋白在转染后42 h开始表达,Western blot进一步证实了这一结果。ELISA结果显示,转染后22 h、27 h、32 h、37 h,各组上清中细胞因子的含量随时间逐渐增多,但各组间的差异均无统计学意义(TNF-α:F=0.445,P=0.837;F=0.579,P=0.742;F=0.617,P=0.714;F=2.728,P=0.057。IL-1β:F=2.656,P=0.062;F=0.485,P=0.809;F=0.165,P=0.982;F=2.463,P=0.093);42 h后,各组细胞因子含量逐渐降低,57 h~62 h,TNF-α及IL-1β含量基本维持稳定;转染后42 h、47 h、52 h、57 h、62 h,实验组两种细胞因子的含量明显高于对照组,差异有统计学意义(TNF-α:F=241.310,P<0.001;F=242.638,P<0.001;F=250.114,P<0.001;F=143.877,P<0.001;F=146.172,P<0.001。IL-1β:F=251.578,P<0.001;F=188.816,P<0.001;F=276.240,P<0.001;F=238.136,P<0.001;F=163.361,P<0.001),各对照组间或实验组间的差异无统计学意义(P>0.05)。结论HIV-1 Nef蛋白能诱导并增强U87细胞分泌TNF-α和IL-1β的能力,而HAD患者体内不同来源的HIV-1 Nef蛋白发生氨基酸变异对U87细胞分泌TNF-α和IL-1β无影响。