山东省肠道病毒71型分离株SDLY11全基因组序列分析

目的了解2009年山东省临沂市分离的肠道病毒71型(EV71)分离株SDLY11的基因组序列特征,探讨病毒的神经毒力候选位点。方法自手足口病患者的粪便标本中分离EV71,采用一步法RT-PCR对病毒株基因组进行全序列扩增,运用DNAstar和MEGA 4软件进行序列分析。结果 SDLY 11基因组全长为7 405nt,其中5′非编码区(UTR)742nt,3′UTR 84nt,中间为6 579nt的开放阅读框架(ORF),编码2 193个氨基酸的多聚蛋白。VP1区及全基因组序列系统进化分析表明SDLY 11位于EV71病毒C4亚型的分支,同源性分析显示SDLY 11与安徽阜阳株同源性最高。序列比对结果发现,CNS累及HFMD患者病毒株在5′UTR区出现了两处核苷酸位点的突变(T40C、C575T),在VP2区第144位出现了氨基酸的突变(T144S)。结论 SDLY 11分离株属EV71病毒C4亚型。5′UTR区的两处突变(T40C、C575T)及VP2区的一处突变(T144S)可能与病毒的致神经毒力作用有关。

肠道病毒71型3D蛋白研究进展

目的 EV71感染可引起婴幼儿手足口病,甚至导致死亡。近年来由EV71引发的手足口病一直呈上升的流行趋势。目前中国对于手足口病的疫苗研究已进入临床试验阶段,但EV71引起的重症手足口病的发病机制仍不明确。3D蛋白主要负责病毒的复制过程,是抗病毒药物的靶点之一。本文就EV71的3D蛋白的结构功能及针对其作为靶点的抗病毒药物作一综述。

新城疫病毒F蛋白细胞融合活性位点中保守氨基酸基因突变分析

为了确定新城疫病毒融合蛋白(F)分子上活性位点中保守氨基酸在F蛋白的细胞融合作用,弄清F细胞融合的分子机理,采用基因定点突变法,创造一个酶切位点,用酶切反应初步筛选突变株,然后用DNA序列分析进一步确定,并于真核细胞内进行表达,Giemsa染色定性和指示基因法定量检测细胞融合功能,荧光强度分析(FACS)检测表达效率情况。结果表明,NDV F第117位苯丙氨酸(F)突变成亮氨酸(L)时对细胞融合作用没有显著影响。R112和K115同为保守序列,分别突变为G时,细胞融合活性只有原来的44%,下降了56%。细胞表面表达效率没有明显的改变。N147突变为K时,细胞融合活性明显下降,只有原来的15%,而细胞表面表达效率没有明显的改变。L154为保守序列,突变为K时,细胞融合活性消失,说明L154是一个非常关键的氨基酸,对维持F蛋白的细胞融合活性非常重要。细胞表面表达效率也有所下降(为原来的94%)。D462属于高度保守氨基酸,当突变为N时,细胞融合活性消失,但经细胞表面表达效率分析证明,此突变蛋白未表达于细胞表面,证明在细胞浆转运至细胞表面的过程中发生了问题。当突变为R和E时,细胞融合活性未发生改变,但细胞表面表达效率有所下降,分别为野毒株的63%和44%。说明NDV F分子上与HN相互作用的特异性区域中的某些保守氨基酸在细胞融合中发挥着重要作用,对F蛋白的折叠、加工、转运等,发挥着不同作用,从而影响F蛋白的细胞融合作用和/或在细胞表面的表达量。

肠道病毒71型山东临沂分离株全基因组序列分析

目的自1例死亡患儿的标本中分离EV71，并分析其全基因组序列特点，研究其基因序列的改变是否与其神经毒力有关。方法咽拭子标本采自山东临沂市人民医院1例死亡患儿，在人横纹肌瘤细胞（RD）上分离EV71，分段扩增获得EV71的全序列，用BLAST、Bioedit和MEGA4进行序列分析。结果获得1株EV71分离株SDLY107，基因组全长7405bp，全基因组核苷酸序列与2008年的阜阳株Fuyang．Anhui．P．R．C／17．08／2同源性最高，为98．6％，与原型株BrCr／70的同源性为80．O％，与神经毒型株MS／87的同源性为86．5％。系统进化分析表明，SDLY107与中国大陆的北京株、河南株、广西株、深圳株、兰州株、阜阳株、重庆株、浙江株的亲缘关系较近，按照传统的VP1基因分型方法，可归为C4亚型，是近年来我国大陆流行的主要基因亚型。氨基酸序列分析发现，SDLY107与其他毒株相比，有2个特有的突变（E947D，K1873R）。结论SDLY107分离株属于C4亚型，氨基酸突变E947D和K1873R可能与EV71的致病性有关。

风疹病毒诱导细胞凋亡分子机制的研究进展

风疹病毒是披膜病毒科风疹病毒属的唯一成员,能够诱导细胞发生细胞凋亡。Ras-Raf-MEK-ERK和PI3KAkt信号通路是病毒增殖与细胞生存的必要通路,在细胞凋亡过程中起着必不可少的作用。p53蛋白和TAp63蛋白能够进入细胞核与DNA特异结合,抑制Bcl-2的表达,促进Bax的表达,导致线粒体内外膜间的物质(细胞色素C等)释放,进而引起caspase级联反应,最终导致细胞凋亡。本文从风疹病毒感染的细胞系,病毒感染导致的细胞病理改变和病毒诱导的细胞凋亡信号通路及其相关因子等方面对风疹病毒诱导细胞凋亡的分子机制进行了综述。

肠道病毒71型山东临沂分离株3D区遗传进化分析

目的构建肠道病毒71型(EV71)山东临沂分离株3D区的系统进化树,进行遗传进化分析,探讨3D区与神经毒力的关系。方法于2009—2010年在山东省临沂市人民医院采集手足口病(HFMD)患儿的粪便标本和咽拭子标本107份,进行EV71的分离;用Bioedit和MEGA 4对EV71山东临沂分离株SDLY1、SDLY11、SDLY48、SDLY96、SDLY107的3D区进行序列分析,参比序列选自GenBank。结果 3D区的系统发生树分析结果显示,5株临沂分离株在发生树上比较集中,SDLY11、96、107的3D区同源性最高,与CoxA16原型株G-10的系统发生关系较近,与EV71原型株BrCr/70的系统发生关系较远;3D区碱基构成比和氨基酸构成比分析显示,含量最高的碱基为A(29%),含量最高的氨基酸为亮氨酸(>10%);基因序列比对和氨基酸序列比对分析结果显示,碱基突变较多,但大多为静默突变,临沂分离株与CoxA16 G-10之间的氨基酸突变中有很大一部分是赖氨酸与精氨酸之间的突变,在SDLY107的3D区发现了3个特有的氨基酸突变:N37S、K142R、G261E。结论 EV71山东临沂分离株3D区的进化可能与CoxA16 G-10有关,突变N37S、K142R、G261E可能与EV71的神经毒力有关。

肠道病毒71型的分子流行病学研究进展

肠道病毒71型（Enterovirus71，EV71）自1974年首次报道以来，全世界很多国家和地区，如保加利亚、日本、韩国、新加坡、法国、澳大利亚、马来西亚均报告了EV71的流行。近年来，有研究表明EV71在亚太地区的流行呈上升趋势，已引起人们的广泛关注。在我国，2007年的山东及2008年的安徽、广东的EV71大规模流行，上万名婴幼儿感染，几十名婴幼儿死亡。现在，EV71已取代脊髓灰质炎病毒成为最主要的婴幼儿中枢神经病毒病原。本文主要就EV71分子流行病学特征方面作一综述，以探索基因变化对EV71流行、致病的影响。

MTT试验检测EV71 2A蛋白对宿主细胞损伤作用

目的在Vero细胞、RD细胞和U87细胞3种细胞系中,研究EV71的2A蛋白对宿主细胞增殖能力的影响及对细胞的损伤作用,揭示2A蛋白在EV71的致病机制中所起的作用。方法将野毒株EV71SDLY 107株(强毒株)、EV71SDLY 1株(弱毒株)和嵌合毒株EV71SDLY 107-2A-1感染Vero细胞、RD细胞、U87细胞后,利用MTT试验测定3种细胞在感染病毒后不同时间点的存活情况,绘制细胞生长曲线,比较细胞增殖程度,并利用单因素方差分析法分析3种细胞在感染不同病毒48h后的存活率;结果 EV71SDLY 107株感染Vero细胞和RD细胞后细胞增殖程度和存活率均低于EV71SDLY 1株(t=41.64,P<0.001;t=33.28,P<0.001);EV71SDLY 107-2A-1嵌合株感染Vero细胞和RD细胞后,细胞增殖程度和存活率均高于亲本病毒EV71SDLY 107株,低于EV71SDLY 1株(t=17.97,P<0.001;t=42.09,P<0.01);EV71SDLY 107-2A-1株感染U87细胞后细胞存活率低于EV71SDLY 1株(t=8.85,P<0.001),但与EV71SDLY 107株感染后细胞存活率无统计学差异(t=0.74,P=0.603);不同细胞感染同株病毒48h后,U87细胞存活率均为最低,Vero细胞存活率均为最高。结论 EV71强毒株的2A蛋白对细胞产生的损伤作用大于弱毒株的2A蛋白,提示2A蛋白在EV71对宿主细胞的作用中发挥功能。

肠道病毒71型疫苗研究进展

肠道病毒71型（enterovirus 71，EV71）是引起手足口病（hand，foot and mouth disease，HFMD）的主要病原体之一，HFMD可并发神经系统疾病，甚至导致死亡。对于EV71感染，目前尚无有效的治疗药物和措施，因此研制有效的疫苗是控制EV71流行的最佳方法。此文就EV71疫苗的研究进展进行综述。

肠道病毒71型分离株基因特征分析

目的了解2009—2010年山东省临沂市肠道病毒71型(EV71)分离株的基因特征,初步探讨VPl区核苷酸或氨基酸变异与不同临床类型的关系。方法从手足口病(HFMD)病例、重症病例和死亡病例的粪便标本中分离获得23株EV71病毒株,RT-PCR扩增VP1区,并进行序列测定和分析。结果 23株分离株与A、B基因型同源性较低;与C4亚型的C4a群代表株的核苷酸和氨基酸同源性分别达到92.8%～93.5%和98.3%～99.3%,明显高于其他亚型代表株的同源性;各分离株间的氨基酸序列比对显示无特征性改变。结论 2009—2010年临沂地区流行的EV71是C4亚型的C4a群,HFMD病例、重症病例和死亡病例分离株VP1区核苷酸序列和氨基酸序列无特征性差异。

肠道病毒71型VP2蛋白对细胞损伤作用

目的研究VP2蛋白在肠道病毒71型(EV71)致病机制中的作用。方法采集山东省临沂市人民医院轻症和重症手足口病(HFMD)患儿的粪便标本(SDLY 11和SDLY 107),应用MEGA 4.0软件对SDLY 11、SDLY107 VP2区氨基酸序列进行比对分析;参考SDLY 11、SDLY 107全序列测序结果设计VP2区扩增引物,构建表达载体VP2p Bluescript SK(+),通过体外转染Vero细胞表达VP2蛋白;乳酸脱氢酶实验检测不同临床症状病毒株的VP2蛋白对细胞损伤的影响。结果序列比对分析结果显示,SDLY 11、SDLY 107 2个病毒株的VP2蛋白在第199位氨基酸处存在差异(V199I);SDLY 11、SDLY 107的VP2蛋白可在Vero细胞中表达;乳酸脱氢酶实验结果显示,2组蛋白对细胞损伤情况差异无统计学意义(P>0.05)。结论 EV71的VP2蛋白可能对细胞损伤的影响不大,其在致病机制中的意义尚需进一步研究。

副黏病毒F蛋白融合活性位点中病毒特异性氨基酸基因突变分析

目的了解副黏病毒融合蛋白（F）融合活性位点中的病毒特异性氨基酸在细胞融合中的作用。方法以新城疫病毒（NDV）和人副流感病毒（hPlV）为例，在已确定的F蛋白融合活性位点中对病毒特异性氨基酸进行定点突变，然后将突变体F基因与同源或异源的血凝素-神经氨酸酶（HN）基因共转染BHK21细胞后，在真核细胞中表达。Giemsa染色和指示基因法检测细胞融合功能，荧光强度分析（FACS）检测F蛋白的表达效率。结果在NDVF的突变体中，N150D—L152D的融合功能达到野毒株的46．31％；而N257D—N258D—Q259E、G271D—N272D和Q279E—Q281E的融合活性却几乎消失，分别只有野毒株的1．25％、3．14％和2．23％；N296D—N297D的融合功能是野毒株的97．68％。在hPIVF的突变体中，D143A－E145A的融合功能达到野毒株的32．63％；E223Q—K224A几乎不能形成合胞体，其融合活性只有野毒株的1．91％：K263A—R265A、D268A—D270A和R475A—R476A的融合功能分别是野毒株的14．63％、19．52％和28．95％。FACS结果表明，NDVF的N257D—N258D－Q259E、G271D—N272D和Q279E—Q281E突变体及hPIVF的E223Q—K224A突变体F蛋白在细胞表面几乎没有表达；其余所有突变体F蛋白的表达效率与野毒株相比，基本不变。结论对于NDVF来说，N257、N258、Q259、G271、N272、Q279、Q281对NDVF的特异性细胞融合功能起重要作用；N150和L152也起一定的作用，但是N296和N297却没有作用。对于hPIVF来说，E223和K224对hPIVF的特异性细胞融合功能起非常重要的作用；D143、E145、K263、11265、D268、D270、R475、R476的作用也很重要。

肠道病毒71型基因组5'非编码区序列分析

目的了解2009年山东省临沂市分离的肠道病毒71型(EV71)基因组5'非编码区(5'UTR)序列特征,探讨基因组中引起神经毒性作用的候选位点。方法从手足口病患者的粪便标本中分离EV71,运用一步法逆转录聚合酶链反应扩增8个病毒株的5'UTR区,运用DNAstar和MEGA 4软件进行序列分析。结果 8个病毒株5'UTR区核苷酸为741～745 nt,核苷酸序列同源性介于97.0%～99.9%,8个病毒株的5'UTR区与C4亚型的同源性最高。序列比对发现,在5'UTR区第265 nt及703 nt处出现了核苷酸的突变(G265A,G703T)。遗传进化分析显示,8个病毒株序列与C4亚型的亲缘关系最为密切。结论此8个病毒株为C4亚型,核苷酸突变(G265A,G703T)可能与EV71的致神经毒性作用有关。

肠道病毒71型嵌合体病毒感染性克隆的构建与鉴定

目的：构建含有弱毒株（SDLY 1株）2A、3B基因片段的强毒株（SDLY 107株）的嵌合体病毒，为进一步研究EV71的毒力建立初步的反向遗传操作平台。方法利用重叠PCR的方法，获得2A、3B基因片段，双酶切后置换到含有SDLY 107株全长的质粒pMD19-T中，利用体外转录获得感染性RNA，转染Vero细胞，成功拯救病毒后经PCR、免疫荧光和免疫印迹对其进行鉴定，测序验证， CCID50和空斑试验测定病毒的滴度。结果成功构建了嵌合体病毒SDLY 107-2A-1和SDLY 107-3B-1感染性克隆，其转染Vero细胞后可观察到典型的细胞病变，PCR试验、间接免疫荧光和免疫印迹试验均证明EV71感染性克隆构建成功，CCID50和空斑试验测得嵌合体病毒SDLY 107-2A-1和SDLY 107-3B-1的滴度分别为1．25×10^5 PFU／ml和0．7×10^5 PFU／ml。结论成功拯救了嵌合体病毒SDLY 107-2A-1和SDLY 107-3B-1，其对细胞病变效应与亲本病毒SDLY 107株相似，为进一步在细胞和体内试验中测定病毒的毒力提供基础研究。

重组肠道病毒71型反向遗传系统构建

目的利用反向遗传技术分别对肠道病毒71型(EV71)强毒株SDLY107和弱毒株SDLY1的3C和3CD编码区进行置换,拯救重组病毒。方法使用PCR技术得到重组片段3C(1)-3D-3'UTR(107)和3CD(1)-3'UTR(107),并克隆入p M D19-T。利用双酶切、T4连接酶将两种重组3CD-3'UTR分别置换入本室构建并保存的EV71的SDLY107株的感染性c DNA克隆p M D19-T-107,得到重组p M D19-T-107后,将其线性化并转染入横纹肌肉瘤(RD)细胞,盲传得到重组病毒107(1-3C)和107(1-3CD)。对收获病毒进行鉴定。结果构建了重组EV71全长c DNA克隆;RNA转染并盲传至第3代,36 h后RD细胞出现细胞病变(CPE),48 h出现明显的CPE,成功拯救重组病毒SDLY107(1-3C)和SDLY107(1-3CD);重组病毒产生的CPE更接近SDLY107。结论成功构建了重组EV71反向遗传系统,拯救了重组病毒SDLY107(1-3C)和SDLY107(1-3CD),为进一步研究3C与3D蛋白在EV71致病机制中的作用提供基础。

肠道病毒71型3CD蛋白对细胞的损伤作用

目的研究肠道病毒71型(EV71)3CD蛋白在致病机制中的作用。方法实验分为对照组、SDLY1组、SDLY107组和SDLY107(1-3CD)组。通过反向遗传技术将弱毒株SDLY1株的3CD蛋白编码区置换到强毒株SDLY107株,形成拯救病毒SDLY107(1-3CD)株。将EV71病毒接种于RD细胞和Vero细胞,于37℃和39.5℃孵育一定时间后,采用MTT试验检测活细胞量,以判断病毒对细胞损伤作用的改变。结果 37℃下,拯救病毒SDLY107(1-3CD)对细胞的损伤作用弱于SDLY107株,但仍强于SDLY1株(P<0.05);39.5℃下,拯救病毒SDLY107(1-3CD)株对细胞的损伤作用较SDLY107株下降(P<0.05),但与SDLY1株的差异无统计学意义(P>0.05)。结论 EV71 3CD编码区的置换可以改变病毒对细胞的损伤作用,3CD蛋白编码区可能存在影响病毒毒力的位点。这一发现有助于理解EV71的致病机制。