山东地区丙型肝炎病毒的基因型及血清学分型的研究

探索山东地区丙型肝炎病毒(HCV)的基因型及血清学分型的分布,了解HCV基因型与感染途径的关系。对96例抗HCV阳性患者的血清进行HCV RNA检测,HCV RNA阳性者,应用限制性片段长度多态性分析(RELP)进行基因分型;同时应用Murex Serotyping HCV 1-6血清学分型试剂进行血清学分型。基因非2(1b)型79 例,占83.16%,2(2a)型为16例占16.84%,44份血清标本的血清学分型可分型率为90.91%,与基因分型的符合率为90.00%。不同的感染途径之间,基因型分布没有差异(P=0.15)。山东地区丙型肝炎病毒流行株为基因非2 (1b)和2(2a)型,非2(1b)型为优势株,基因分型与血清学分型结果基本一致,基因型与丙型肝炎的感染途径无关。

应用ntPCR-RFLP技术检测乙型肝炎病毒阿德福韦耐药变异

目的建立一种简便、快速、实用的乙型肝炎病毒(HBV)阿德福韦(ADV)耐药变异-rtN236T变异及rtA181V变异的快速检测方法。方法根据GenBank收录的HBV基因全序设计巢式PCR引物,使野生株rt236N PCR产物中含有DraⅠ酶切位点(5'-TTTAAA-3'),而变异株rt236T无此限制性酶切位点;使野生株rt181A PCR产物中含有BlpⅠ酶切位点(5'-GCTNAGC-3'),而变异株rt181V无此限制性酶切位点。选取4份应用ADV治疗1年以上出现HBV DNA反跳的临床耐药慢性乙型肝炎患者血清,经PCR扩增、限制性内切酶酶切及凝胶电泳,进行限制性片段长度多态性(RFLP)分析。并选择经该方法鉴定的野生株及变异株各1例进行HBV RT区基因序列分析。结果建立的ntPCR-RFLP方法可以检测到102copies/L的HBV DNA;RFLP分析结果与DNA测序结果一致,4份血清标本中检测到1份rtN236T变异,2份rtA181V变异。结论应用ntPCR-RFLP方法检测HBV阿德福韦耐药变异具有灵敏、特异、简便的优点,适用于HBV耐药变异的监测。

拉米夫定治疗乙型肝炎失代偿期肝硬化长期疗效观察

目的观察慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染所致失代偿期肝硬化患者应用拉米夫定抗病毒治疗的疗效和安全性。方法60例伴有HBV复制的失代偿期肝硬化患者（Child—Pugh B级20例，C级40例）接受拉米夫定抗病毒治疗，剂量为100mg或150mg，每日1次，早期同时给予支持及对症治疗。在治疗1、2、3、4、5和6年时分别进行疗效评价。结果所有患者治疗3-6个月后症状和体征逐渐改善，腹水消失。未发生YMDD变异者，血清转氨酶、黄疸、白蛋白和Child—Pugh计分的改善贯穿于整个治疗过程。治疗1、2、3、4、5和6年时，丙氨酸氨基转移酶复常率分别为87．8％、87．0％、85．9％、84．3％、79．8％和76．5％；天冬氨酸氨基转移酶复常率分别为78．2％、79．3％、75．7％、73．2％、74．2％和72．1％；总胆红素复常率分别为65．6％、85．2％、78．1％、72．3％、78．6％和76．5％；白蛋白复常率分别为86．9％、85．2％、92．9％、85．6％、86．4％和71．2％；治疗前Child—Pugh计分为12．61±2．05，服药1-6年后分别降至10．7±3．1、8．7±1．6、7．5±1．2、7．2±1．2、6．9±0．8和6．9±0．6；血清HBVDNA阴转率分别为91．4％（53／58）、82．7％（43／52）、83．7％（41／49）、76．7％（33／43）、65．7％（23／35）和73．7％（14／19）；血清HBeAg／抗HBe转换率分别为32．6％（15／46）、43．1％（19／42）、46．3％（19／41）、52．3％（19／35）、48．4％（15／31）和40％（6／15）。累计23例发生YMDD变异。累计存活率59．6％（34／57）。结论拉米夫定治疗HBV所致失代偿期肝硬化，可迅速控制病毒复制，改善肝功能，降低Child—Pugh计分，促使HBeAg／抗HBe血清转换。长期用药安全，耐受性好。

肝性脑病大鼠肝和脑组织一氧化氮及一氧化氮合酶的研究

目的:探讨一氧化氮(NO)与肝性脑病(HE)的关系。方法:用硫代乙酰胺(TAA)制造大鼠HE模型,35只大鼠随机分为2组,HE模型组25只,正常对照组10只。HE模型组第1天均腹腔注射TAA300mg·kg-1,第2～4天,每日分别注射TAA150mg·kg-1,直至出现HE症状。正常组每日注射等量生理盐水。采用分光光度法测定两组大脑、小脑、肝组织中NO含量和一氧化氮合酶(NOS)活性。结果:HE模型组大脑、小脑、肝组织中NO含量与正常组比较明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.05,P<0.01);NOS活性与正常组比较明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.05,P<0.01);HE模型组大脑、小脑、肝组织中NO含量与NOS活性呈正相关(r=0.7284,r=0.8220,r=0.7010;P<0.001)。结论:NO可能是肝性脑病的重要影响因素之一。

HBV感染者外周血单个核细胞内HBVDNA的检测及临床意义

探讨HBV感染者外周血单个核细胞(PBMC)中HBVDNA的检出情况,观察拉米夫定抗病毒治疗后PBMC中HBVDNA的变化。常规分离65名HBV感染者和10名健康体检者的PBMC,裂解PBMC抽提总DNA,并进行HBVDNA的定量检测。其中7名HBV感染者进行拉米夫定抗病毒治疗。HBVDNA阳性者其PBMC中HB- VDNA的检出率为90．2%(46/51),HBVDNA阴性者中检出率为7．1%(1/14)。7例HBVDNA阳性的慢性HBV感染者经拉米夫定抗病毒治疗后,血清及PBMC中HBVDNA定量均逐渐降至检测水平以下,PBMC中HBVDNA的消失较血清无明显延迟(P＞0．05)。HBV感染者其PBMC有较高的HBV感染率。拉米夫定对血及PBMC中HBVD- NA均有明显的抑制作用。

多房棘球绦虫elp基因核酸疫苗诱生免疫应答的实验研究

目的观察多房棘球绦虫elp基因核酸疫苗免疫BALB/c小鼠引起的体液和细胞免疫应答。方法30只BALB/c小鼠随机分成3组:Ⅰ组,肌注空质粒(pcDNA3.1)100μg/鼠;Ⅱ组,肌注多房棘球绦虫elp基因真核表达重组质粒(pcD-ELP)100μg/鼠;NS组,肌注等体积生理盐水。每2周免疫1次,共3次。ELISA方法检测免疫后不同时间产生的特异性IgG1,IgG2a和IgG 2 b水平。双抗体夹心ELISA法检测免疫鼠脾脏单个核细胞(PMNC)在受到特异抗原刺激后,产生IL-4I、L-12和IFN-γ的能力,3H-TdR掺入法检测脾淋巴细胞的增值能力。结果首次免疫后4周,Ⅱ组小鼠血清可检测到特异性IgG1I、gG2a和IgG2b抗体,随免疫时间和免疫次数的增加3种特异性抗体的OD值逐渐增高,实验结束时(首次免疫后7周)3种特异性抗体OD值均最高。Ⅰ组和Ⅱ组小鼠脾PMNC培养上清中IFN-γ浓度分别为50 pg/ml和55 pg/ml,受特异抗原刺激后分别为44 pg/ml和101.5 pg/ml。NS组IFN-γ及各组IL-4和IL-12均未检出。Ⅰ组和Ⅱ组小鼠脾淋巴细胞增殖能力增高,其淋巴细胞CPM值分别为NS组的85倍和123倍,受到特异抗原或刀豆素刺激其淋巴细胞增殖更明显。结论多房棘球绦虫elp基因核酸疫苗可刺激BALB/c小鼠同时产生很强的细胞免疫和体液免疫应答。

多房棘球绦虫ELP抗原在大肠埃希菌中的表达及其在免疫诊断中的初步应用

目的实现多房棘球绦虫ELP蛋白在大肠埃希菌中的表达,制备高纯度、高特异性的重组抗原,为多房棘球绦虫感染的流行病学调查和临床诊断提供新的工具。方法在建立了多房棘球绦虫elp基因克隆的基础上,应用亚克隆方法将目的基因插入原核非融合表达载体pQE30(+)。经酶切鉴定,转化于大肠埃希菌,以IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE及Westernblot进行鉴定。亲和层析纯化ELP蛋白,用于ELISA检测患者血清特异性抗体。结果酶切鉴定、SDS-PAGE及Westernblot分析证实,成功地构建了pQ-ELP原核非融合表达载体,该载体转化大肠埃希菌在IPTG诱导下能高效表达ELP蛋白。ELP重组抗原用于ELISA检测18份包虫病人血清均阳性,10份华支睾吸虫病、27份乙肝病毒感染者和10份健康人血清均为阴性。结论多房棘球绦虫ELP抗原在大肠埃希菌中得到了高效非融合表达,初步实验结果显示该重组蛋白对包虫病具有较高的诊断价值。

高效液相色谱法测定血清中拉米夫定的含量

目的:建立用高效液相色谱快速检测拉米夫定血药浓度的方法。方法:用10％高氨酸和20％三氯乙酸直接沉淀血清蛋白,三氯甲烷抽提血清杂质成分,离心后取上清液进行色谱分析;色谱柱为Shim-Pack VP-ODS柱,流动相为0.02mol·L^(-1)磷酸盐缓冲液(pH7.0)-乙腈-甲醇(91:0.1:9),流速为1.5mL·min^(-1),紫外检测波长274nm,喷昔洛韦为内标。结果:拉米夫定的保留时间为7.9min,定量线性范围0.050～4.0mg·L^(-1)(r=0.9998),方法回收率大于94.60％(n=5)。日内RSD<4%,日间RSD<7%,n=5。结论:本法简便快速、定量准确,适用于拉米夫定人体临床药代动力学和生物利用度的研究。

单用拉米夫定与联合α干扰素治疗慢性乙型肝炎的疗效观察

目的 观察和对比单用拉米夫定与拉米夫定联合α干扰素治疗慢性乙型肝炎的安全性和疗效。方法 拉米夫定组 6 4例 ,单服拉米夫定 ,10 0mg或 15 0mg ,每日 1次 ,其中 5 4例 ( 84.4% )用药超过 12个月。联合组 49例 ,拉米夫定用药 2周后加用干扰素 (甘乐能或罗荛愫 ) ,3MU～ 5MU肌肉或皮下注射 ,每周 3次 ,2 4周后停干扰素 ,继续服拉米夫定 ,其中 38例 ( 77.6 % )治疗超过 12个月。两组在治疗 6个月、12个月时分别进行疗效评价 ,并继续随访 4～ 2 6个月。结果 拉米夫定组和联合组 6个月时ALT/AST复常率分别为 90 .6 % /92 .2 %和 89.8% /93.9% (P >0 .0 5 ) ;HBVDNA阴转率分别为 96 .9%和 98.0 % (P >0 .0 5 ) ;HBeAg的血清转换率为 2 0 .3%和 2 8.6 % (P >0 .0 5 )。 12个月时两组ALT/AST的复常率分别为 90 .7% /90 .7和 89.5 % /92 .1% (P >0 .0 5 ) ;HBVDNA阴转率为 88.9%和 89.5 % (P >0 .0 5 ) ;HBeAg的血清转换率则分别为 31.5 % ( 17/5 4)和 5 5 .3% ( 2 1/38) ,P <0 .0 5。HBeAg的血清转换率似乎与治疗前的转氨酶水平较高、HBeAg和HBVDNA水平较低有关。治疗 9～ 2 4个月期间拉米夫定组 9例 ( 14 .1% )、联合组 6例 ( 12 .2 % )发生HBV多聚酶YMDD变异。结论 拉米夫定和干扰素联合治疗慢性乙型肝?

拉米夫定治疗中乙肝病毒多聚酶YMDD变异对患者临床经过的影响

目的 :研究乙肝病毒 (HBV)多聚酶YMDD变异后HBVDNA复现对慢性HBV感染患者临床经过的影响。方法 :用mpPCR RFLP技术检测 2 4例拉米夫定治疗过程中出现HBVDNA复现的患者血清 ,对YMDD变异者的系列临床资料 ,应用SAS软件进行统计学分析。结果 :检出YMDD变异 18例 ;YMDD变异后转氨酶水平较HBVDNA转阴时有显著升高 ,并反跳至治疗前水平。结论 :出现YMDD变异后 ,部分病例可有类似肝炎发作、甚至肝脏失代偿的表现。

拉米夫定治疗中HBV多聚酶M204V/M204I和L180M变异的检测及意义

目的:建立以PCR-RFLP检测HBV多聚酶M204V/M204I和L180M变异的方法,探寻上述位点变异之间的关系。方法:构建质粒pUCm-V+M/I+L,采用基因序列测定技术以确证PCR-RFLP检测HBV多聚酶M204V/M204I和L180M变异的方法。采用建立的方法对拉米夫定治疗过程中发生耐药变异的41例慢性HBV感染患者进行YMDD变异类型的检测。结果:①建立了检测HBV多聚酶M204V/M204I和L180M变异的PCR-RFLP方法,且与基因序列测定的结果一致;②HBV多聚酶M204V变异,占YMDD变异的31.7%(13/41),均伴有L180M变异;M204I变异占YMDD变异的68.3%(28/41),其中46.4%(13/28)伴有L180M变异。结论:①HBV多聚酶M204V/M204I和L180M变异的PCR-RFLP检测方法可靠;②M204V变异均伴有L180M变异,46.4%的M204I变异也伴有L180M变异。

拉米夫定治疗中乙肝病毒聚合酶YMDD变异的早期预测因子研究

目的：建立ＨＢＶ多聚酶ＹＭＤＤ变异的快速检测方法，并藉此进行临床流行病学研究，以了解应用拉米夫定治疗乙肝过程中ＹＭＤＤ变异的发生率及其早期预测因子。方法：收集９１例应用拉米夫定治疗的慢性ＨＢＶ感染者临床资料及系列血清。应用ｍｐＰＣＲＲＦＬＰ技术检测治疗过程中ＨＢＶ ＤＮＡ复现患者的ＹＭＤＤ变异情况，并采用ＳＰＳＳ软件进行统计学分析。结果：检出ＹＭＤＤ变异３５例（３８．５％），其累计发生率在治疗１２和１８个月时分别为２０．４８％、５３．４６％。拉米夫定治疗前诊断为肝硬变者ＹＭＤＤ变异出现较早（Ｐ＝０．０２７９），在慢性肝炎中ＨＢｅＡｇ阳性者ＹＭＤＤ出现较早（Ｐ＝０．０２９６）。Ｃｏｘ比例风险模型显示：肝硬变（Ｐ＝０．００９２）和ＨＢｅＡｇ阳性（Ｐ＝０．０７７８）与ＹＭＤＤ变异有关。结论：慢性肝炎中ＨＢｅＡｇ阳性和肝炎肝硬变可作为拉米夫定治疗过程中ＹＭＤＤ变异的早期预测因子。

5种多房棘球绦虫续绦期幼虫的制备RNA方法比较及长片段DNART-PCR扩增方法研究

目的探讨从多房棘球绦虫续绦期幼虫制备RNA的最佳方法,研究逆转录PCR扩增DNA长片段目的基因的方法。方法应用改良的琼脂糖核酸电泳方法和RT-PCR技术比较观察了5种商品化RNA/mRNA提取试剂/试剂盒用于提取多房棘球绦虫续绦期幼虫RNA的效果;用琼脂糖凝胶电泳方法观察比较了不同的DNA聚合酶用于RT-PCR扩增长片段EMⅡ/3(1.72kb)和EM10(1.76kb)的效果。结果总RNA提取试剂盒(RNeasyTotalRNAKit)提取的多房棘球绦虫续绦期幼虫RNA电泳显示出清晰的28S、18SrRNA条带和弥散于0.8kb至20kb之间未降解的mRNA,是唯一能逆转录扩增出单一目的条带的核酸提取物。TaqDNA聚合酶与高保真DNA聚合酶Pfu的混合制剂TaqPlus应用于RT-PCR可扩增出大量1720bp和1760bp单一目的基因。结论总RNA提取试剂盒(RNeasyTotalRNAKit)对多房棘球绦虫续绦期幼虫RNA的提取效果最好;TaqPlus适合用于RT-PCR扩增长片段目的基因。

血清25-羟维生素D3与慢性HBV感染者的相关性研究

目的探讨血清25-羟维生素D3与慢性HBV感染者的相关性。方法收集济南市传染病医院2015年1月—2019年1月门诊及住院的慢性HBV感染患者620例,根据疾病的严重程度分为4组,即无症状ASC组(ASC)120例,慢性乙型肝炎组(CHB)160例,乙型肝炎肝硬化组(LC)200例,肝细胞性肝癌组(HCC)138例;同时,选取同期健康查体者140名作为健康对照(Healthcontrol,HC)。回顾性收集患者的乙肝病毒学和血清学标志物、肝功及生化指标、影像学资料等,并检测所用纳入者的血清25-羟维生素D3(25(OH)D3)的含量。结果性别与年龄组成:HC组共140例,平均年龄(31.96±8.91)岁;慢性HBV感染者620例,平均年龄(43.14±13.60)岁,慢性HBV感染者平均年龄高于HC组,差异有统计学意义(t=-7.75,P<0.001)。各组血清25(OH)D3含量:HC组平均含量(32.99±7.33)ng/mL,患病组平均含量(29.28±7.33)ng/mL,两组差异有统计学意义(t=4.64,P<0.001)。,健康组与慢性HBV患者25(OH)D3缺乏状态的比较,25(OH)D3含量(ng/mL)正常(≥30 ng/mL)、不足(20-29.9)、缺乏(≤19.9 ng/mL),HC组分别为105、30、5例;慢性HBV感染者分别为320、220、80例;(χ~2=18.42,P<0.001)。各组HBVDNA载量,高HBVDNA载量随着病情的进展呈逐渐降低的趋势,以HCC组所占比例最低;各组间差异有统计数意义(P<0.001)。结论血清25-羟维生素D3与慢性HBV感染者具有明显的相关性,可以作为肝炎的参考指标。