医学微生物学实验教学理念与改革思路

探讨医学微生物学实验教学理论创新,指导教学改革。选取2007学年来医、卫、口、护、药、留学生班学员,采用系列融合实验新编教材,讲授一套完整的实验技术路线,替代原有分散零星的知识点,PBL式教学讨论。大学生自主创新的热情被激发,实验报告及论文水平提高,实践操作技能考试通过率及优秀率升高。通过实践系列性创新融合实验,互动教学,可以明显激发大学生的热情和自身潜力,系统掌握医学微生物学实验,为医学生今后学习临床课程、医疗实践、基础研究打下了坚实的基础,收到了良好的教学效果。

加强实验教学改革,提高医学微生物学教学质量

为提高医学微生物学实验教学质量，激发学生学习兴趣、培养科学思维、掌握实验操作技能，进行了一些改革和探索。文章从整合实验教学内容，开发综合性试验；引入设计性实验教学法，发挥学生主观能动性；加强实验室建设，重视生物安全方面以及改进实验教学手段，增添实验内容等方面进行了阐述。

侵袭性牙周炎与慢性牙周炎病变位点中人巨细胞病毒的定量检测

目的应用实时荧光定量PCR方法检测侵袭性牙周炎(AgP)及慢性牙周炎(CP)患者龈下样本中人巨细胞病毒(HCMV)的DNA载量,探讨HCMV感染与牙周炎之间的关系。方法选择18例AgP患者、24例CP患者及15例牙周健康对照者,收集龈下样本114例。构建含有HCMV高保守片段的重组质粒,制备标准品DNA模板,建立并应用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,检测样本中HCMV的DNA载量。结果 AgP病变位点、CP病变位点以及牙周健康位点中HCMV的阳性检出率分别为58.3%、41.7%和6.7%。AgP和CP病变位点中HCMV的阳性检出率显著高于牙周健康位点(P<0.01)。在AgP病变位点中,病毒载量在104以上的位点占33.3%,明显高于CP病变位点的10.4%,两组之间的差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 HCMV感染与牙周炎的发生发展密切相关,其活动性感染可能与AgP组织破坏的迅速进展有关。

人唇腺和腮腺CCL28表达比较

目的比较人小涎腺与大涎腺CCL28的表达差异,以期探讨CCL28在小涎腺IgA分泌中的作用。方法应用实时荧光定量PCR技术,分别检测13例健康成人唇腺和8例健康成人腮腺标本中CCL28mRNA表达的相对量;然后用SPSS10.0统计软件对数据进行秩和检验。结果CCL28mRNA在人的唇腺中有丰富的表达,并且唇腺中的CCL28mRNA的表达量高于腮腺(P<0.01)。结论唇腺中CCL28表达量显著高于腮腺,说明小涎腺分泌高浓度IgA可能与CCL28高表达有关。

滴鼻接种HPV16 L1-E7 DNA初始引发及HPV16 L1 VLP强化免疫可增强小鼠黏膜和细胞免疫

目的探讨HPV16 L1-E7 DNA疫苗初始引发及HPV16L1病毒样颗粒(VLP)强化接种小鼠诱发免疫反应的效应,为进一步用于HPV16相关恶性肿瘤的防治提供实验依据。方法以HPV16 L1-E7嵌合蛋白、HPV16 L1 VLP以及HPV16 L1-E7 DNA单独或联合滴鼻免疫雌性BALB/c小鼠,连续使用3周。免疫后采血及收集阴道分泌物,检测特异性抗体。在末次免疫2周后,取小鼠脾细胞,用HPV 16 L1-E7蛋白刺激,检测T细胞增殖反应及IFN-γ水平。结果HPV16 L1-E7嵌合蛋白滴鼻接种可诱导小鼠产生血清HPV16 L1特异性IgG,强化免疫后抗体水平明显增高(P<0.01);阴道局部产生HPV16 L1特异性IgA;在HPV16 L1-E7抗原刺激下,脾细胞上清液中IFN-γ水平升高。HPV16 L1-E7 DNA疫苗初始引发和HPV16 L1蛋白加强免疫可增高阴道分泌液中HPV16 L1特异性IgA水平,增高脾淋巴细胞中特异性T细胞产生IFN-γ的水平。结论嵌合病毒样颗粒HPV16 L1-E7和HPV16 L1-E7 DNA疫苗初始引发及HPV16 L1蛋白强化滴鼻接种适用于预防HPV原发性黏膜感染和治疗HPV16相关肿瘤。

小鼠骨髓树突状细胞的诱导培养及抗CT-26肿瘤细胞的研究

目的:研究小鼠骨髓树突状细胞的诱导培养及其抗肿瘤特性。方法:用重组的鼠粒-巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)及白细胞介素4(IL-4)从小鼠骨髓干细胞中诱导培养树突状细胞(DC),用流式细胞仪检测DC表型。肿瘤细胞CT-26冻融液负载DC后,治疗荷瘤BALB/c小鼠,测定DC抑瘤、消瘤作用及小鼠的生存期变化。结果:诱导的DC形态典型,表面高表达CD80、CD86、I-Ad等免疫分子。抗原负载的DC能明显抑制早期肿瘤的生长,治疗组与非治疗组生存期差异有统计学意义。结论:树突状细胞早期应用具有明显抗CT-26肿瘤细胞作用,可延长荷瘤小鼠的生存期。

促进乳头状瘤病毒L1蛋白表达和DNA疫苗免疫效应的研究

目的探讨促进乳头状瘤病毒(PV)晚期基因L1的蛋白表达和DNA疫苗免疫效应的途径及可能的机制。方法分别将含人源化优化密码BPVL1-GFP融合基因(HL1-GFP)和野生型BPVL1-GFP融合基因(WL1-GFP)的真核表达质粒体外单独转染或与tRNAser真核表达质粒共转染人角质形成细胞HaCAT,荧光显微镜及Western blot方法观察L1-GFP融合蛋白的瞬时表达情况。半定量RT-PCR分析不同PV L1基因mRNA的表达。BALB／c小鼠股四头肌内分别接种野生型、优化密码L1 DNA疫苗,同时将L1 DNA疫苗与tRNAser真核表达质粒混合后接种小鼠,观察诱导产生的体液免疫反应。结果野生型WL1-GFP融合基因在HaCAT细胞中未能有效表达,优化密码HL1-GFP基因在HaCAT细胞中的蛋白表达水平明显增强;但两者在mRNA水平差异无统计学意义。WL1-GFP与tRNAser真核表达质粒共转染细胞中L1蛋白的表达较单独转染WL1-GFP基因时增强。动物DNA免疫结果表明,优化密码HL1 DNA疫苗接种可使小鼠特异性L1中和抗体水平明显升高;而野生型WL1 DNA疫苗接种组小鼠仅产生低滴度的L1抗体,WL1 DNA疫苗与tRNAser真核表达质粒混合接种使小鼠的L1抗体水平增加。结论优化密码能显著促进乳头状瘤病毒晚期基因L1在哺乳动物细胞中的表达和DNA疫苗的免疫反应;补充外源tRNAser基因能够提高野生型L1基因的蛋白表达和DNA疫苗诱导的体液免疫应答。

鼠衣原体肺部感染中自然杀伤细胞对白细胞介素-22产生及疾病进程的影响

目的探究小鼠衣原体(Chlamydia)肺部感染中自然杀伤(NK)细胞对白细胞介素-22(IL-22)产生及疾病进程的影响。方法 36只小鼠分为实验组和对照组,每组18只。实验组小鼠尾静脉注射anti-asialo GM1,以封闭体内NK细胞,同时鼻吸入含鼠衣原体(Chlamydia muridarum)的感染液;对照组小鼠尾静脉注射同型对照抗体,感染方法同实验组。每天记录小鼠体质量变化;分别于感染后6、12 d,检测小鼠肺部衣原体包涵体形成单位(IFU);实时荧光定量PCR、ELISA方法检测小鼠脾脏中IL-22的表达,细胞内细胞因子染色技术检测小鼠脾脏Th17细胞数量变化。结果与对照组相比,实验组小鼠肺部感染加重,体质量降低趋势加大、肺部IFU增加(P<0.05),脾脏中IL-22的mRNA和蛋白表达水平减少(P<0.05),且Th17细胞的百分比和绝对数量均降低(P<0.01)。结论 NK细胞封闭导致小鼠体内IL-22的表达降低、肺部感染加重,提示NK细胞与IL-22的表达存在相关性;NK细胞可通过促进IL-22的产生,从而增强机体抗衣原体感染的能力。

重组腺病毒介导的RbAp48基因表达对人宫颈癌细胞生长、增殖的影响

目的构建携带RbAp48基因序列的重组腺病毒,检测其对宫颈癌细胞系SiHa肿瘤细胞行为的影响。方法构建穿梭质粒pDC316-RbAp48,与骨架质粒pBHGloxΔE1,3Cre共转染HEK293细胞,获得复制缺陷型重组腺病毒Ad5-RbAp48,Ad5-RbAp48感染人宫颈癌细胞SiHa,采用免疫印迹法检测RbAp48表达,使用WST-8、细胞计数及软琼脂克隆形成实验,研究Ad5-RbAp48介导RbAp48高表达对SiHa细胞增殖与非锚定依赖性生长的影响。结果成功构建并鉴定重组腺病毒Ad5-RbAp48,Ad5-RbAp48感染SiHa细胞导致RbAp48高效表达,并有效抑制SiHa细胞增殖能力与非锚定依赖性生长能力。结论 RbAp48重组腺病毒可介导RbAp48高效表达,具有抑制宫颈癌细胞肿瘤细胞行为的作用。