尿胞外体亮氨酸氨基肽酶及二肽基肽酶在糖尿病肾病中的变化

目的:探讨2型糖尿病患者尿液胞外体的亮氨酸氨基肽酶(exosome-LAP)及二肽基肽酶4(exosome-DPP4)的水平变化在糖尿病肾病发展过程中的意义。方法:选取127例2型糖尿病患者,根据24h尿白蛋白肌酐比(UACR)分为糖尿病正常白蛋白尿组(DM,43例)、微量白蛋白尿组(DN1,50例)和大量白蛋白尿组(DN2,34例)。另选健康对照组34例。采用特异性的单克隆抗体提纯胞外体,酶联免疫吸附法(ELISA)检测尿液胞外体的exosome-LAP和exosome-DPP4。同时检测糖化血江蛋白(HbA1c)、血胆固醇(CH)、肌酐(CR)、尿素氮(BUN)。应用多元逐步回归方法分析DPP4及LAP与HbA1c、CH、UACR、CR、BUN相关性。结果:DM、DN1、DN2组exosome-LAP和exosome-DPP4水平均显著高于正常组(均P<0.01);与DM组比较,DN2组exosome-LAP水平显著升高(P<0.01)。尿exosome-LAP、exosome-DPP4与HbA1c、CH、UACR、CR、BUN显著相关。逐步多元回归分析显示,CH、UACR是exosome-LAP的独立危险因素(均P<0.01);UACR、HbA1c是exosome-DPP4的独立危险因素(均P<0.01)。结论:Exosome-LAP和exosome-DPP4水平与糖尿病肾病严重程度密切相关,以上指标对于糖尿病肾病的诊断及预后估计具有一定临床价值。

胆碱能系损伤老化鼠的脑神经肽表达与学习能力改变

目的 探讨兴奋性神经毒素定位损伤脑胆碱能神经元的老化大鼠行为及脑组化改变 ,及在 AD发病中兴奋性毒素脑损伤的机制。方法 分别用兴奋性毒素鹅膏蕈氨酸 (IBA)、N-甲基 - D-天冬氨酸 (NMDA)定位损伤老化大鼠脑右侧 Meynert核。用 Y型迷宫法和分光光度法检测损伤大鼠学习能力和脑胆碱酯酶 (Ach E)活性改变 ,并用免疫组化染色法测定损伤动物脑神经肽 :β-淀粉样肽前体 (β- APP)、生长抑素 (SOM)及 P物质(SP)的表达。结果 脑损伤大鼠与对照组比较 ,表现学习能力及脑胆碱酯酶活性显著降低 (均 P<0 .0 5) ;鼠脑额叶皮层和海马区显示β- APP的表达明显升高 ;而生长抑素阳性神经元数量则显著减少。用 IBA及 β- AP2 5- 3 5同时或 NMDA损伤鼠脑时 ,可显示脑皮质区 P物质过表达 (均 P<0 .0 1 ) ;用IBA单独注射时 ,SP表达无显著改变。结论 以 IBA、NMDA定位损伤老化大鼠脑 Meynert核后 ,显示鼠脑胆碱能系统损伤 ,学习能力障碍 ,β- APP、P物质表达明显增多 ,可能与脑中 β- AP的沉积有关。神经肽 SOM表达降低可能致动物学习能力下降。该 AD模型动物表现 AD类似临床和病理特征。

短发夹RNA干扰表达质粒逆转人乳腺癌细胞MCF-7／ADR多药耐药的研究

目的构建靶向多药耐药基因(MDR-1)的短发夹RNA(short hairpin loop RNA shRNA)干扰表达质粒,并探讨其逆转人乳腺癌细胞MCF-7/ADR多药耐药的作用效果。方法根据MDR-1基因表达序列设计有效的RNA干扰片断,构建并获得MDR-1基因特异的shRNA质粒表达载体pRNAT-U6.1/Neo-mdr1,采用lipofectin2000分别转染人乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR,利用G418筛选稳定表达的细胞克隆。利用RT-PCR检测MDR-1-RNA的表达,WesternBlotting检测MDR-1蛋白质的表达,MTT法检测耐药逆转效果,罗丹明123外排实验检测p-gp的转运功能。结果成功构建表达siRNA的质粒载体pRNAT-U6.1/Neo-mdr1,转染人乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR后48 h及G418筛选后1、2月,mdr1-RNA及蛋白质表达均呈明显下降,p-gp的转运功能明显提高,对阿霉素的敏感性增强,与耐药细胞及转入空白载体的细胞比较,差异有统计学意义(P均<0.05)。筛选后1、2月与转入48 h比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论shRNA干扰表达质粒pRNAT-U6.1/Neo-mdr1能够稳定、持久的抑制MDR-1基因,逆转乳腺癌细胞MCF-7/ADR对阿霉素的耐药性。

maspin基因启动区的初步鉴定

目的:研究maspin基因表达的调控机制。方法:利用PCR技术扩增maspin基因5'上游启动区860bp(-765～+95bp)不同的缺失片段,并将它们分别与荧光素酶(LUC)报告基因相连,构建了6种maspin-LUC报告基因表达质粒,通过转染实验检测maspin启动区不同长度片段在雄激素依赖性前列腺癌细胞(LNCaP)和雄激素非依赖性前列腺癌细胞(PC-3M)中驱动荧光素酶表达的活性。并转染雄激素表达受体(AR)到PC-3M细胞,观察雄激素及其受体对不同片段表达活性的作用。结果:maspin基因启动区(-312～247bp)之间含有与雄激素受体相关的负性调控元件,在(+14～95bp)之间含有一个功能性的中文(Sp1)调控元件。结论:maspin基因的表达受雄激素受体及Sp1的调节。

β-AP脑损伤老化鼠认知能力和脑组化改变研究

目的 用 β-淀粉样肽 (β- AP)损伤鼠脑胆碱能神经元 ,了解 β- AP对动物认知能力和神经元的损害及 NO在其中的作用。方法 将 β-AP2 5- 3 5定位注射至老化 1 8月龄大鼠脑右侧 Meynert核 ,观察损伤动物学习能力改变 (Y型迷宫法 )。分光光度法检测脑胆碱酯酶 (Ach E)活性 ,并用免疫组化染色法观察鼠脑一氧化氮合酶 (NOS)及凋亡相关蛋白 Bax、Bcl- 2的表达情况。结果 与对照组比较 ,脑损伤老化鼠表现学习能力及脑胆碱酯酶活性显著降低 (均 P<0 .0 1 ) ;NOS2 和 Bax在额叶皮层和海马的表达均升高 ,而 Bcl- 2表达则显著减少 (P均 <0 .0 1 )。结论 β- AP2 5- 3 5定位损伤脑Meynert核老化大鼠显示胆碱能系统损伤 ,学习能力障碍 ,NOS2 和 Bax表达增加而 Bcl- 2表达降低 ,提示损伤脑有 NO过量生成并诱导发生神经元凋亡损伤。这与 AD病人某些临床和病理特征基本一致。

LDL-ACM复合物对裸鼠皮下移植瘤靶向抑制作用的初步研究

目的 :通过观察比较LDL -ACM复合物和游离ACM对胃癌SGC - 790 1 ,NKM - 4 5细胞株裸鼠皮下移植的抑制效应 ,从而了解LDL作为抗癌药物靶向载体的应用价值。方法 :首先采用温育交换法制备LDL -ACM复合物 ,然后建立人胃癌细胞株裸鼠皮下移植瘤模型 ,以瘤重、肿瘤体积、白细胞计数、抑瘤率、生命延长率等指标观察LDL -ACM对移植瘤的抑制作用。结果 :LDL -ACM组的移植瘤生长速度明显慢于生理盐水组及游离ACM组 ,抑瘤率和生命延长率明显高于生理盐水组及游离ACM组 ,外周白细胞计数无明显变化 ,尤其对SGC - 790 1瘤更为明显。结论 :LDL -ACM复合物与游离ACM相比有更强的抑癌效应。LDL

SiRNA联合asODN靶向逆转白血病细胞多药耐药的研究

目的:探讨靶向多药耐药基因(MDR-1)的siRNA和asODN联合应用逆转人白血病耐药细胞K562/A02的效果。方法:设计并合成针对MDR-1基因同一序列的siRNA和asODN及阴性对照siRNA,采用转染试剂lipofectin2 000分别转染人白血病耐药细胞K562/A02;利用RT-PCR检测MDR-1mRNA和Western Blot检测MDR-1蛋白质的表达;采用罗丹明123外排实验检测P-糖蛋白(P-gp)的转运功能,MTT法检测K562/A02细胞对阿霉素的耐药逆转效果。结果:siRNA、asODNa、sODN和siRNA联合应用均能降低MDR-1mRNA和蛋白质的表达,提高P-gp的转运功能,对阿霉素的敏感性明显恢复,asODN和siRNA联合应用效果明显提高(P<0.05),低浓度的siRNA(200 nmol/L)比高浓度的asODN(5μmol/L)的效果强(P<0.05)。结论:siRNA、asODN能有效地逆转人白血病耐药细胞K562/A02的多药耐药,asODN和siRNA联合应用效果明显加强。

尿大分子碱性磷酸酶在窒息新生儿肾损害早期诊断中的意义

目的:研究窒息新生儿肾损害时尿大分子碱性磷酸酶(HMAP)水平的变化及其在肾功能早期损害诊断中的意义。方法:利用抗HMAP的单克隆抗体,用ELISA方法检测69例窒息新生儿(包括轻度窒息39例和重度窒息30例)治疗前后及36例正常新生儿(对照组)尿HMAP的水平,并测定两组尿β2-微球蛋白(β2-MG)和血清尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)的水平。结果:窒息组治疗前尿HMAP、β2-MG水平高于治疗后(t=17.01和9.56,P<0.001)和对照组(t=13.38和9.45,P<0.001),且重度窒息组高于轻度窒息组(t=2.48和2.14,P<0.05);窒息组尿HMAP、β2-MG的异常发生率(86.96%和69.57%)高于血清BUN、Cr的异常发生率(24.64%和46.38%)(χ2=7.61,P<0.01),尿HMAP的异常发生率高于β2-MG的异常发生率(χ2=6.13,P<0.05)。尿HMAP与β2-MG呈直线正相关(r=0.648,P<0.001)。结论:窒息新生儿普遍存在肾功能损害,尿HMAP能比β2-MG更灵敏地反映窒息后肾损害的程度,可作为监测窒息新生儿肾损害的早期诊断指标。

E2F陷阱DNA对前列腺癌PC-3M细胞凋亡的诱导

目的:为观察转录因子E2F陷阱DNA对雄激素非依赖性前列腺癌细胞PC-3M增殖和凋亡的影响。方法:采用脂质体lipofectam ine将E2F decoy DNA、ARE decoy DNA和control decoy DNA分别转染PC-3M细胞,MTT检测其对细胞增生的影响,倒置相差显微镜观察细胞形态变化,流式细胞术检测细胞凋亡率,并进行染色体DNA断裂的测定;通过RT-PCR检测转染的PC-3M细胞中c-Myc mRNA、cyc lin D1 mRNA表达水平的变化,通过W estern b lotting检测细胞中c-Myc蛋白、cyc lin D1蛋白表达水平的变化。结果:E2F decoy DNA转染后的PC-3M细胞的生长受到明显抑制;转染后的细胞形态变化符合凋亡的典型改变,染色体断裂明显,细胞凋亡率为26.35%;c-Myc、cyc lin D1的表达受到抑制。结论:E2F decoy DNA可诱导雄激素非依赖性前列腺癌PC-3M凋亡和抑制细胞增殖,其机制可能涉及到c-Myc mRNA、cyc lin D1的表达变化。

卡氏肺孢子虫特异性DNA探针的制备及其实验应用

目的制备特异、敏感的卡氏肺孢子虫(Pc)DNA探针,用于检测卡氏肺孢子虫肺炎(PCP)患者临床标本中的PcDNA。方法PCR扩增获得Pc的线粒体核糖体RNA大亚基基因,以其为模板,采用随机引物法制备半抗原地高辛标记的探针。检测探针的敏感性和特异性后,用斑点杂交法检测实验大鼠肺组织和PCP患者临床标本中的PcDNA。结果敏感性检测显示该探针可检出2pg水平的PcDNA,特异性检测显示该探针仅与PcDNA杂交,而不与伯氏疟原虫、恶性疟原虫、弓形虫、人白细胞及正常大鼠肺组织DNA反应。斑点杂交检测PCP大鼠肺组织中的PcDNA,检出率为73.7%,低于PCR结合斑点杂交的检出率94.7%。用该探针从1例肾移植术并发PCP患者的支气管肺泡灌洗液中检测到PcDNA。结论制备的PcDNA探针具有敏感性高、特异性好、无放射性污染等优点,对PcDNA有良好的检测效果。

IBA损伤老化鼠脑Meynert核的AD模型动物研究

目的 :研究定位损伤脑胆碱能系Alzheimer病 (AD)模型大鼠学习能力及相关脑神经肽免疫组化改变。方法 :用兴奋性毒素鹅膏蕈氨酸 (IBA)定位损伤大鼠脑右侧Meynert核 ,观察模型动物学习能力改变 (Y型迷宫法 ) ,并用分光光度法和免疫组化染色法观察动物脑胆碱酯酶 (AchE)活性和皮层及海马 β 淀粉样肽前体 (β APP)、生长抑素 (SOM )及P物质 (SP)的表达情况。 结果 :模型组老化大鼠经损伤后 ,学习能力及脑AchE活性显著低于对照组 (P均 <0 .0 5 )。β APP在额叶皮层和海马的表达均升高 ,而SOM表达则显著减少 ,用IBA及β AP2 5- 3 5同时损伤鼠脑时 ,可显示脑皮质区SP表达增加 (P均 <0 .0 1) ,单独用IBA注射无效。结论 :IBA损伤老化大鼠脑Meynert核建立的动物模型 ,显示胆碱能系统损伤 ,学习能力障碍 ,β APP过表达而神经肽SOM表达降低 ,一定条件下SP表达增加 ,与AD病人某些临床和病理特征基本一致。

HL-60细胞分化与凋亡关系的初步研究

目的 :探讨HL 6 0细胞分化与凋亡的初步关系 ,指导白血病的联合化疗。方法 :NBT还原试验检测细胞分化、流式细胞术 (FCM )检测细胞凋亡及bcl 2、c myc蛋白的表达 ,观察分别经ATRA、TPA诱导分化的HL 6 0细胞对VP 16的凋亡反应。结果 :与对照组相比 ,经ATRA、TPA分化的HL 6 0细胞bcl 2、c myc蛋白表达都明显降低 (P <0 .0 5 ) ,其中以TPA下调c myc蛋白的幅度最大 (76 % ) ;对VP 16的诱导反应 ,经TPA分化的HL 6 0细胞凋亡率明显减少 (P <0 .0 5 ) ,而经ATRA分化的细胞凋亡率则无明显变化 (P>0 .0 5 )。结论 :HL 6 0细胞对VP 16的凋亡诱导反应与bcl 2、c myc蛋白的下调表达程度有关 ;分化诱导剂ATRA与低剂量的VP 16联合应用可望改善AML的化疗效果 ,并且以后者先用效果更好。

人同源盒基因Nkx3.1启动子的克隆及活性测定

目的:克隆Nkx3.1基因5＇上游1.06 kb片段,构建pGL3-1.06 kb载体,测定其启动子活性?方法:采用PCR方法从人基因组DNA中扩增Nkx3.1基因5＇上游1.06 kb片段并构建到荧光素酶报道基因pGL3-basic 载体中,与内参照质粒pRL-Tk共转染前列腺癌LNCaP细胞,通过双荧光素酶活性检验测定其启动子活性?结果:PCR扩增的1.06 kb片段经测序正确无误;pGL3-1.06 kb转染LNCaP细胞48 h后,双荧光素酶活性测定M1/M2=2.7, 为pGL3-control 活性的1.5倍,为pGL3-basic活性的50倍?结论:克隆的人Nkx3.1基因5＇上游1.06 kb片段具有较强的启动子活性?

人NKX3.1基因启动子的克隆及在不同肿瘤细胞系中启动子活性的测定(英文)

目的:克隆NKX3.1基因启动子并检测其启动子活性,为研究NKX3.1基因转录调控的基本机制奠定基础。方法:采用PCR方法从人基因组中扩增NKX3.1基因上游1.04 kb启动子片段并分别克隆到报道基因载体pGL3-basic和pEGFP-1中,通过转染细胞、荧光素酶活性测定及荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,检测其启动子活性。结果:DNA测序结果证实克隆的1.04 kb启动子片段序列正确;pGL3-1.04 kb启动子转染LNCaP细胞后,双荧光素酶活性测定M1/M2=2.7,为pGL3-control活性的1.5倍,为pGL3-basic活性的50倍。表明克隆的人NKX3.1基因上游1.04 kb片段具有较强的启动子活性。为检测此1.04 kb启动子在不同组织细胞中的活性,分别将pGL3-1.04 kb启动子和pEGFP-1.04 kb启动子转染入不同的肿瘤细胞系,检测荧光素酶和绿色荧光蛋白的表达。结果显示1.04 kb启动子在前列腺癌细胞LNCaP中活性最高。采用TRANSFAC数据库分析,发现在1 040 bp片段内含有多种顺式作用元件,它们的功能性将需要进一步实验证明。结论:克隆的人NKX3.1基因上游1.04 kb片段具有较强的启动子活性,并且在前列腺癌细胞LNCaP中活性最高。

LTC_4合酶基因敲除靶向载体的构建

目的:构建鼠LTC4合酶基因靶向敲除载体,用于转染鼠胚胎干细胞,建立LTC4合酶基因敲除鼠。方法:分离、克隆LTC4合酶基因的1.85kb和1.35kb片段,作为靶向载体的5'同源臂和3'同源臂,重组到pJNS2载体中,筛选鉴定阳性重组子。结果:构建的靶向载体由5'同源臂-Neo-3'同源臂-hTk-pJNS2构成。结论:经DNA测序及限制性酶切鉴定分析,该构建载体结构及序列正确,可用于转化鼠胚胎干细胞。

低密度脂蛋白-阿克拉霉素复合物对卵巢癌靶向治疗的研究

目的 :研究卵巢癌 3AO细胞对阿克拉霉素 低密度脂蛋白复合物 (ACM LDL)及游离ACM的摄取及ACM LDL对卵巢癌细胞的靶向杀伤作用。方法 :采用保温交换法制备ACM LDL复合物 ,观察在相同的作用时间下 ,卵巢癌 3AO细胞对ACM LDL复合物及游离ACM的摄取量 ,测定细胞蛋白合成量及MTT法观察ACM LDL复合物对卵巢癌细胞的杀伤作用。结果 :( 1)相同的作用时间内 ,卵巢癌 3AO细胞摄取ACM LDL复合物的量显著高于游离ACM ;( 2 )ACM LDL复合物对卵巢癌细胞具有剂量依赖性的生长抑制作用 ,当药物浓度达到 2 0 μg/ml时 ,细胞生长停止 ;( 3)ACM LDL复合物对卵巢癌细胞的杀伤作用显著强于游离ACM ,ACM LDL复合物的半数抑制量 (ID50 )为 5 μg/ml ,而游离ACM的ID50为 2 0 μg/ml。 结论 :通过LDL受体 (LDLR)的转运作用 ,以LDL为载体 。

E2F陷阱DNA对前列腺癌细胞增殖的影响

目的观察转录因子E2F陷阱DNA策略对雄激素非依赖性前列腺癌细胞PC-3M增殖的影响。方法采用脂质体Lipofectamine将E2FdecoyDNA、AREdecoyDNA和ControldecoyDNA分别转染PC-3M细胞,倒置相差显微镜观察细胞形态变化,MTT检测其对细胞增生活性的影响。结果E2FdecoyDNA转染后的PC-3M细胞的生长受到明显抑制,转染后的细胞形态变化。结论E2FdecoyDNA明显抑制雄激素非依赖性前列腺癌PC-3M细胞增殖。