霍乱弧菌HutX蛋白的晶体结构

目的获取纯化的霍乱弧菌HutX蛋白晶体和衍射数据。方法通过基因克隆和蛋白表达得到HutX蛋白,通过镍柱亲和层析、Source Q阴离子交换柱层析和Superdex 200分子筛柱层析等纯化所得蛋白,并用蛋白质印迹法进行验证。将所获蛋白进行结晶条件筛选及悬滴优化,X线衍射分析所得晶体的结构。结果蛋白质印迹分析间接证明所得到的蛋白为HutX蛋白,并得到HutX蛋白的晶体及衍射数据。结论为进一步研究HutX的蛋白结构及其在霍乱弧菌亚铁血红素利用机制中发挥的作用提供了参考。

基于位点相关概率模型的富亮氨酸重复序列预测

富亮氨酸重复序列(leucine-rich repeat,LRR)是一种广泛存在的蛋白质结构基序,在诸多重要生命过程中起关键性作用并与诸多人类疾病紧密相关。研究LRR中各个位点之间的氨基酸分布的相关性,并基于此相关性建立概率模型,可应用于序列水平上的LRR预测,以提高LRR预测的准确度。本文从LRRML数据库中提取已知的LRR蛋白质序列作为训练集和测试集;为LRR各个位点上氨基酸的分布数据构建4种不同的概率模型,包括位点相关和位点不相关概率模型;再通过机器学习和K-折交叉验证的方法,确定可以用于LRR预测的最佳模型。结果表明,位点相关概率模型和位点不相关概率模型以不同权重相加之后的综合模型在LRR预测中显示出高的准确度。LRR中各个位点之间的氨基酸分布存在一定的相关性,此相关性可作为重要参数应用于LRR预测。

利用重建祖先基因方法研究连续诱导培养大肠杆菌对恩诺沙星抗药性突变的规律

目的研究大肠杆菌对氟喹诺酮抗药性突变的规律及基因型与表型的对应关系。方法以质控菌株Escherichia coli ATCC 25922为初始菌株,恩诺沙星浓度由0.031 25μg/mL增加到128μg/mL,分步诱导得到13株稳定的抗药性菌株,检测氟喹诺酮靶酶基因gyrA、gyrB和parC、parE的序列及其突变位点,检测恩诺沙星的最低抑菌浓度(MIC)及抑制外排泵后MIC,分析抗药性表型与基因型、蛋白结构、外排泵及生化特性的关系。结果低浓度氟喹诺酮可诱导GyrA的Ser83-Leu和ParC的Glu84-Lys单一位点突变,致低水平抗药性,而Ser83-Leu逐步与Asp87-Gly、Glu84-Lys组合,导致氟喹诺酮突变决定区突变位点氨基酸的极性、空间位阻变化,影响靶蛋白与DNA和恩诺沙星的结合,可致高水平抗药性。外排泵与基因突变共同作用,使细菌耐受逐步升高药物浓度,M IC基本平行高出培养浓度1倍。结论增加恩诺沙星的使用剂量,能诱导高抗菌株产生,恩诺沙星抗药性表型与基因型具有对应关系和规律性变化。

ALS小鼠脊髓组织GFAP蛋白赖氨酸的乙酰化修饰

目的探讨肌萎缩脊髓硬化症(ALS)模型小鼠脊髓组织胶质纤维酸性蛋白(GFAP)中赖氨酸的乙酰化修饰。方法对4个月左右的ALS模型小鼠进行麻醉处死,提取小鼠脊髓组织总蛋白,通过GFAP抗体和乙酰化抗体,运用免疫沉淀和免疫蛋白印迹技术鉴定GFAP蛋白的表达与GFAP蛋白赖氨酸的乙酰化修饰,通过液相二级质谱连用(LC-MS/MS)检测ALS模型小鼠脊髓组织中GFAP赖氨酸的乙酰化修饰位点。结果免疫沉淀和免疫蛋白印迹方法发现ALS模型小鼠脊髓组织中GFAP蛋白存在赖氨酸乙酰化修饰;LC-MS/MS发现GFAP的394位和402位赖氨酸位点发生乙酰化修饰。结论 ALS小鼠模型脊髓组织中,GFAP的赖氨酸位点能被乙酰化修饰,该修饰可能参与了ALS的发生。

人乳头瘤病毒早期癌蛋白E6/E7稳定表达细胞系的构建及其对Rab12表达的影响

目的探究人乳头瘤病毒(HPV)编码的早期癌蛋白E6/E7对小GTP酶蛋白Rab12表达的影响。方法利用逆转录病毒包装系统获得含p Babe-Vector质粒和p Babe-16E7质粒的高滴度病毒颗粒,感染细胞,并用嘌呤霉素筛选获得稳定表达HPV16E7的UMSCC 10A-16E7细胞系,Western blotting检测E7相关蛋白p53和E2F1的表达变化,比较UMSCC 10A-Vector细胞系和UMSCC 10A-16E7细胞系的Rab12蛋白表达水平。用同样方法在Ha CaT、RPE1细胞系中进一步验证。用siRNA干扰SiHa、Caski细胞(HPV-16阳性的宫颈癌细胞)中16E6/E7及He La细胞(HPV-18阳性的宫颈癌细胞)中18E6/E7的表达,通过Western blotting比较siRNA干扰前后E6和E7相关蛋白(E2F1、p53和Rab12)的表达差异。结果利用逆转录病毒包装系统成功构建稳定表达的细胞系,过表达E6/E7的细胞系中Rab12表达升高,干扰E6/E7的细胞系中Rab12的表达降低。结论 HPV编码的早期癌蛋白E6/E7可调控Rab12的表达。