临床医学8年制组织学胚胎学教学改革与实践

临床医学8年制教育的试行是我国医学教育改革的一项重大举措，是培养高素质、高水平、富有创新能力的高端人才的重要途径。组织学与胚胎学课程是基础医学中的骨干课程，也是医学教育中的必修课程，同时还是医学生动手实践最早的学科之一，为了更好适应8年制医学教育培养人才的需求，我们积极改革教学内容，寻求有效的教学方法与手段，并取得了良好的教学效果。

改革组织学与胚胎学实验课教学,努力实施素质教育

提高学生的综合素质，培养高水平的医学人才，已成为医学教育改革的一项重要内容。根据组织学与胚胎学实验课特点，通过开展实验技能和科研培训、重视对学生的人文医学教育、改革教学方法和教学模式、加强外语教学等多种措施和手段，在提高学生的综合素质方面取得了较好的效果。

改革教学模式 提高组织学实验课教学质量

为适应教育体制由传统的应试教育向素质教育转变，培养高质量人才的需要，近几年来，我们在传统教学模式的基础上，根据形态学科的特点，积极改革，探索新的、有益的教学方法，2004年我室组织胚胎学课程被评为精品课程。我们主要从以下几个方面，采取不同形式的改革措施和手段，在提高实验课教学质量的同时，培养学生的创新能力和良好的素质，为培养高素质的创新性人才打下坚实的基础，获得良好的效果。

小鼠胚胎干细胞构建嵌合体的方法

目的 利用本实验室新近分离培养的远交系KM小鼠胚胎干细胞进行嵌合体构建实验。 方法 从KM小鼠囊胚的内细胞团中分离培养胚胎干细胞 ,进行近交系C5 7BL 6J小鼠受体囊胚腔内注射 ,进行嵌合体构建实验。 结果 从内细胞团中分离的胚胎干细胞具有胚胎干细胞的典型特征 ,克隆状生长 ,碱性磷酸酶染色呈强阳性 ,核型正常 ,悬浮培养能形成类胚体 ,已成功构建 1只嵌合鼠。 结论 利用我们分离的KM小鼠胚胎干细胞可成功地构建嵌合体。

维甲酸致小鼠胚胎畸形发生过程中维甲酸受体α/β及β-catenin和caspase-3基因的表达变化 (英文)

流行病学研究显示,在胚胎发育过程中摄入过多维甲酸可致各种发育缺陷,其中神经管畸形最为常见. 因此有必要探明维甲酸致各种发育缺陷的发生机制,以便为各种生长缺陷的预防和治疗提供实验依据. 用 RT-PCR 及蛋白质印迹技术,探测了过量维甲酸对昆明小鼠胚胎神经管中维甲酸受体α/β及β-catenin 和 caspase-3 基因表达的调整. 结果显示,在神经管闭合期过量维甲酸显著降低了维甲酸受体α/β及β-catenin 和 caspase-3 的基因表达,神经管闭合后,维甲酸受体β、β-catenin 及 caspase-3 的基因表达又出现了一个明显的回升过程. 提示,过量维甲酸改变了昆明小鼠胚胎神经管中维甲酸受体α/β及β-catenin 和 caspase-3 基因的正常时间表达模式,这种异常的基因表达模式可能参与了维甲酸致昆明小鼠胚胎畸形的发生机制.

降钙素受体在小鼠早期胚胎及围植入期子宫内膜的表达

目的:检测降钙素受体(calcitoninreceptor,CTR)在不同发育阶段小鼠胚胎和植入期子宫内膜表达的变化。方法:取小鼠早期胚胎、未孕、真孕及假孕3～7d小鼠子宫,利用免疫组织化学染色结合图像分析法,检测CTR在不同发育阶段早胚及植入期子宫内膜中的表达。结果:①CTR在小鼠植入前胚胎表面呈阳性表达,随着妊娠进展,其表达逐渐加强;②真孕组孕3d,小鼠子宫内膜CTR呈弱阳性表达,孕4～5d表达达到高峰,此后腔上皮CTR表达水平下降;假孕组,小鼠子宫内膜CTR呈弱阳性表达;未孕组小鼠子宫内膜CTR呈阴性表达。结论:①CTR参与了早期胚胎发育分化的调节以及子宫内膜容受性的形成;②启动子宫内膜容受性形成的信号不仅来自母体及交配刺激,还来自胚胎。

无血清培养条件下诱导胚胎干细胞向多巴胺能神经元定向分化的实验研究

目的 寻求无血清、无饲养层细胞存在的情况下 ,胚胎干细胞向多巴胺能神经元定向诱导分化的最佳条件。 方法 采用阶段诱导的方法 ,在不同阶段加入不同的生长因子 ,对新近分离的胚胎干细胞进行分化培养。首先向无血清培养液中分别加入bFGF和LIF ,实现由胚胎干细胞向神经前体细胞的定向分化 ,通过巢蛋白(nestin)免疫细胞化学染色对神经前体细胞进行鉴定 ;在此基础上 ,撤除bFGF和LIF ,加入B2 7无血清培养基、IL 1后继续培养 ,实现由神经前体细胞向多巴胺能神经元的定向诱导分化 ;通过酪氨酸羟化酶 (TH)免疫细胞化学染色对多巴胺能神经元进行鉴定。 结果 有 85 %的细胞团呈nestin免疫阳性着色 ,多巴胺能神经元的分化比率为13% ,较多巴胺能神经元的自然分化比率 (4 % )有明显提高。 结论 在无血清、无饲养细胞的情况下 ,我们采用阶段诱导的方法 ,在不同的阶段加入不同的生长因子 ,可有效诱导多巴胺能神经元的分化 ,使胚胎干细胞的诱导分化过程更易于操作。

过量维生素A酸对金黄地鼠胚胎神经管维生素A酸受体α、β基因表达的影响

目的:探讨过量维生素A酸(RA)对金黄地鼠胚胎神经管RA受体α和RA受体β基因表达的影响。方法:采用RTPCR方法,半定量分析金黄地鼠神经管正常发生及RA致神经管畸形过程中RA受体α和RA受体βmRNA表达水平的变化。结果:过量RA可使RA受体α和RA受体βmRNA在金黄地鼠神经管中的表达水平呈现短时下降,而后又大幅上升的变化。结论:过量RA引起的RA受体α和RA受体βmRNA表达水平的变化与RA致金黄地鼠神经管畸形相关。

昆明小鼠胚胎干细胞大鼠侧脑室内移植诱导分化的在体研究

目的:探讨脑内微环境诱导胚胎干细胞向神经细胞分化的状况,确定胚胎干细胞脑内移植的最佳分化阶段。方法:将未分化的昆明小鼠胚胎干细胞和经维甲酸初步诱导分化的胚胎干细胞分别进行侧脑室内移植,通过苏木素伊红(HE)染色、尼氏染色和神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫组织化学染色,检测胚胎干细胞移植后的存活和分化情况。结果:未分化的昆明小鼠胚胎干细胞侧脑室内移植后,不能很好地向神经细胞方向分化,有形成畸胎瘤的倾向。而经维甲酸初步诱导分化的胚胎干细胞进行侧脑室移植后4周,移植物中有相当一部分细胞为NSE免疫阳性细胞,部分细胞的胞浆中可见尼氏小体,具有神经细胞的典型特征。结论:经过维甲酸诱导后,胚胎干细胞发生了向神经细胞的分化,在侧脑室微环境中可以存活,并朝着神经细胞方向分化。

维甲酸致胚胎神经管畸形过程中RARα和RARβ表达水平变化的实验研究

目的:探讨过量维甲酸(RA)对金黄地鼠胚胎神经管维甲酸受体α(RARα)和维甲酸受体β(RARβ)蛋白表达的影响。方法:采用免疫组织化学方法及图像分析,半定量分析金黄地鼠神经管正常发生及RA致神经管畸形过程中RARα和RARβ表达水平的变化。结果:过量RA可使RARα和RARβ在金黄地鼠神经管中的表达水平呈现短时下降,而后又大幅上升的变化。结论:过量RA引起的RARα和RARβ表达水平的变化与RA致金黄地鼠神经管畸形相关。

KM小鼠胚胎干细胞大鼠纹状体内移植诱导分化的在体研究

目的探讨体外培养扩增的胚胎干细胞移植到纹状体内的存活、迁移和分化情况,确定胚胎干细胞脑内移植的最佳分化阶段。方法分别将未分化的胚胎干细胞和诱导分化至神经前体细胞阶段的胚胎干细胞进行纹状体内移植,移植4周后通过形态学观察、尼氏染色、TH与BrdU免疫组织化学染色,检测胚胎干细胞移植后的存活和分化情况。结果初步诱导分化后的胚胎干细胞纹状体内移植后4周,移植区内有大量BrdU免疫阳性细胞出现,而且部分BrdU免疫阳性细胞已迁移出移植区,有些细胞已分化为TH免疫阳性细胞,胞浆内可见尼氏体;而未分化的胚胎干细胞进行脑内移植后有成瘤的趋向。结论在体外对胚胎干细胞进行诱导分化至神经前体细胞阶段,然后进行脑内移植,更有利于胚胎干细胞的存活和部位特异性分化。

纹状体星形胶质细胞诱导小鼠胚胎干细胞定向分化的研究

目的 探讨纹状体组织对胚胎干细胞向多巴胺能神经元分化的定向诱导作用 ,及其细胞来源和诱导方式。 方法 分别用纹状体组织提取液、纹状体星形胶质细胞条件培养液和纹状体神经元条件培养液诱导胚胎干细胞定向分化 ,通过形态学观察和酪胺酸羟化酶 (TH)免疫细胞化学检测 ,对细胞的分化情况进行鉴定 ,并对 3组结果进行定量比较分析。 结果 纹状体组织提取液对胚胎干细胞有明显的定向诱导作用 ,向多巴胺能神经元诱导分化的分化率为 15 % ;纯化培养的纹状体星形胶质细胞条件培养液对胚胎干细胞的定向诱导作用与纹状体组织液无明显差异 ,分化率为 15 2 % ;纯化培养的纹状体神经元条件培养液对胚胎干细胞向多巴胺能神经元诱导分化的作用很弱 ,其分化率仅为 3%。 结论 纹状体组织对胚胎干细胞向多巴胺能神经元定向诱导分化作用主要来源于纹状体中的星形胶质细胞 ,而这种诱导作用主要通过非接触性方式实现。

小鼠胚胎神经管发育过程中WGA、RCA和ECL凝集素受体的表达及其意义

目的:探讨WGA、RCA和ECL凝集素受体与小鼠胚胎神经管发育的关系。方法:根据受孕天数将30只雌性昆明小鼠随机分为6组,每组5只。以生物素标记的凝集素WGA、RCA和ECL为探针,应用亲和细胞化学染色和图像分析方法检测上述三种凝集素受体在各组小鼠胚胎神经管上皮及其周围间充质的分布状况和变化规律。结果:三种凝集素受体均存在于不同发育阶段的小鼠胚胎神经管上皮,但三者的表达部位、表达水平的变化趋势均不相同。其中,WGA受体和ECL受体在各组神经管头部、体部和尾部表达的总体趋势均是先下降后上升;而RCA受体在各组神经管头部和尾部表达的总体趋势是逐渐上升,在体部则是逐渐下降。三种凝集素受体在神经管头部和尾部的表达均强于神经管的体部,以WGA受体和RCA受体更为明显。结论:WGA受体、RCA受体和ECL受体都直接或间接参与了神经管形态构建过程,并且在这一过程中三种受体均发生着规律性的时空变化。

Caspase-3在维A酸致小鼠胚胎神经管畸形中的表达及意义

目的:探讨Caspase-3在维A酸(RA)致小鼠胚胎神经管畸形发生过程中的表达及意义。方法:40只未经产昆明种小鼠随机分为实验组和对照组各4小组,每小组5只。分别在花生油及RA处理18、42、66、90 h后剖腹取胎、剥离头部神经管,Western-bloting法检测Caspase-3的表达变化。结果:Caspase-3在正常胚胎神经管组织中的表达存在时间依赖性。对照组Caspase-3在花生油灌服后18 h表达升高,42 h和66 h时表达最强,之后表达逐渐降低。实验组Caspase-3在RA处理后42 h表达水平显著低于对照组(P<0.01),66 h和90 h时表达水平均显著高于对照组(P<0.01)。结论:RA改变了昆明种小鼠胚胎神经管中Caspase-3的正常时间表达模式,这种异常的基因表达模式可能参与了RA诱导的神经管畸形发生。

小鼠胚胎腭板发育过程中麦胚凝集素、蓖麻凝集素和鸡冠珊瑚树凝集素受体的表达

方法：以生物素标记的凝集素WGA、 RCA和ECL为探针,应用亲和组织化学显色方法检测上述3种凝集素受体在各组小鼠胚胎腭板上皮及其间充质的分布状况和变化规律.结果：在小鼠胚胎腭发育过程中3种凝集素受体在腭板上皮中的表达水平均高于在间充质中的表达水平.WGA受体在腭板上皮中的表达峰值出现于d1322-d148,即腭板上抬和水平生长期;而RCA和ECL受体的表达峰值出现于d158-d1522,即腭板融合期.结论：3种凝集素受体均可能不同程度地参与腭板正常发育的调节,WGA受体可能主要作用于腭板上抬和水平增长期,而RCA和ECL受体则可能主要作用于腭板融合期.

顶端钠离子依赖性胆汁酸转运体在小肠癌组织中的表达及其意义

目的:研究顶端钠离子依赖性胆汁酸转运体(ASBT)在小肠癌组织中的表达,探讨其在小肠癌发生中可能的意义。方法:采用免疫组织化学显色和蛋白印迹检测ASBT在人小肠腺癌、黏液腺癌、小细胞癌及其癌旁正常组织中的表达。结果:ASBT在癌旁正常小肠组织主要表达于小肠吸收细胞游离面的胞膜;在小肠癌中,ASBT表达明显下调,在小肠黏液腺癌和小细胞癌还可见ASBT的细胞核异位表达。结论:ASBT在小肠癌组织中表达下调和异位表达提示编码ASBT的基因第10溶质转运蛋白家族第2成员(SLC10A2)可能作为一种新的抑癌基因在小肠癌的发生过程中起重要作用。

新生小鼠精原细胞分离和纯化的实验研究

目的:分离和纯化7～8d新生雄性小鼠精原细胞,为深入研究生精机理及其影响因素提供细胞来源和技术支持。方法:采用组合酶消化法制备7～8d雄性小鼠的生精细胞悬液;Percoll密度梯度离心法分离精原细胞,贴壁培养法进一步纯化精原细胞;滴片进行碱性磷酸酶染色;取同时间段雄性小鼠睾丸组织冰冻切片进行碱性磷酸酶染色。结果:精原细胞主要分布于45%～55%梯度间的Percoll中,经贴壁培养后纯度达75.2%。结论:用上述方法成功地分离和纯化了小鼠精原细胞。

低频脉冲磁场对脑缺血再灌注损伤大鼠神经元保护作用的研究

目的研究低频脉冲磁场对脑缺血再灌注损伤大鼠海马神经元的保护作用。方法将24只SD大鼠随机分成磁辐射组和对照组(每组12只),应用改良的Pulsineli法制作大鼠全脑缺血再灌注模型;将磁辐射组大鼠头部置于低频脉冲磁场(20mT、10Hz)辐射45min,每天1次,连续4d。进行脑电图监测,用Nissl染色及免疫组化方法检测海马神经元数及caspase-3蛋白阳性细胞数。结果磁辐射组脑电图振幅[(10.27±1.12)μV]和频率[(10.06±1.02)Hz]较对照组[(8.95±1.04)μV、(8.62±0.94)Hz]显著增加(均P<0.05);磁辐射组海马神经元数[(29.02±1.32)个/高倍镜视野]较对照组[(21.25±1.06)个/高倍镜视野]增多,磁辐射组caspase-3蛋白阳性细胞数[(21.33±1.32)个/高倍镜视野]较对照组[(28.34±1.10)个/高倍镜视野]减少,两组相比差异具有统计学意义(均P<0.05)。结论低频脉冲磁场可以减轻脑缺血再灌注后海马神经元的损伤及凋亡,对脑缺血再灌注损伤有保护作用。

降钙素在围植入期小鼠子宫内膜中的表达

目的:探讨降钙素在胚泡植入过程中的生物学作用。方法:取未孕动情期、真孕及假孕3～8d的小鼠子宫作切片,用免疫组织化学方法和图像分析方法对降钙素在围植入期子宫内膜中的表达进行定性和定量分析。结果:降钙素仅分布于子宫内膜腺上皮。在真孕及假孕组小鼠,受精后第3～4d(植入前),子宫内膜腺上皮中降钙素的含量均明显高于未孕组(P<0.01);受精后第6～7d(植入后),真孕小鼠子宫内膜中降钙素的含量进一步增多,明显高于假孕及植入前各时间组(P<0.01)。结论:①降钙素参与胚泡植入过程,还可能间接参与植入后胚泡的滋养层扩展、分化及子宫内膜蜕膜化反应;②降钙素在子宫内膜中的表达不仅受母体因素调控,还与胚泡的刺激有关。

zdhhc17对斑马鱼集中延伸运动的调节及其机制

目的通过抑制zdhhc17基因的表达,探讨其在斑马鱼胚胎发育过程中的作用及机制。方法通过显微注射zdhhc17吗啉反义寡聚核苷酸(MO)抑制zdhhc17翻译,观察斑马鱼胚胎发育过程中相关表型的变化。利用斑马鱼整封原位杂交技术,检测集中延伸运动相关标记基因(dlx3b、ntl、myod1、tbx6等)的表达变化。利用RT-PCR技术,检测集中延伸运动相关调控因子mRNA表达水平的变化。结果敲除zdhhc17基因后,斑马鱼胚胎集中延伸运动出现严重缺陷,主要表现为尾部弯曲变短(82/118),且集中延伸运动相关标记基因表达异常,钙黏附蛋白家族cdh1、padh18a mRNA水平降低。结论 zdhhc17通过调节钙黏附蛋白家族cdh1、padh18a基因的表达,进而影响细胞黏附运动,最终参与调控斑马鱼胚胎集中延伸运动。