中国山东汉族人群TIM-3基因启动子区域两单核苷酸多态与支气管哮喘的相关性

目的:检测中国山东汉族人群T细胞免疫球蛋白域和粘蛋白域蛋白-3(T-cell immunoglobulin do-main and mucin domain protein-3,TIM-3)基因启动子区域的单核苷酸多态(single nucleotide polymorphism,SNP)位点T-882C以及T-574G的多态性,探讨TIM-3基因启动子区域的单核苷酸多态与汉族人群支气管哮喘易感性的关系。方法:采用聚合酶链反应-限制性片断长度多态性(polymerase chain reaction and restriction fragmentlength polymorphism,PCR-RFLP)法检测449例哮喘患者以及386例正常对照TIM-3基因启动子区域单核甘酸多态位点T-882C及T-574G的基因型,计算基因型频率及等位基因频率,进行χ2检验。结果:T-882C及T-574G在中国汉族人群中处于完全连锁不平衡状态,其基因型频率及等位基因频率一致;T-882C位点TT/TC/CC基因型频率以及T-574G位点TT/TG/GG基因型频率在病例组中为0/0.042 3/0.957 7,在对照组中为0/0.018 1/0.981 9;两位点的基因型、等位基因分布以及单倍体型分布在哮喘组与对照组之间均有统计学差异。结论:中国汉族人群TIM-3基因启动子区域单核苷酸多态T-882C、T-574G与支气管哮喘易感性相关。

山东汉族人群STAT4基因启动子区域单核苷酸多态与支气管哮喘的相关性

目的分析信号转导子及转录激活因子4(signal transducer and activator of transcription4,STAT4)基因启动子区域单核苷酸多态(single nucleotide polymorphism,SNP)位点rs16833431A>G多态性与山东汉族人群支气管哮喘发生的相关性。方法采用聚合酶链式反应-限制性片断长度多态(polymerase chain reactionand restrictionfragment length polymorphism,PCR-RFLP)方法检测220例哮喘患者和233例正常对照STAT4基因启动子区域多态位点rs16833431A>G的基因型,计算基因型与基因频率,采用χ2检验进行组间比较。结果STAT4基因rs16833431多态位点AA、AG、和GG基因型频率在病例组中分别为0.536、0.377和0.086,在对照组中分别为0.515、0.399和0.086,A和G等位基因的频率在病例组分别为0.725和0.275,在对照组分别为0.715和0.285,该位点基因型和等位基因分布在病例组与对照组均无统计学差异。结论STAT4基因启动子区域rs16833431A>G位点单核苷酸多态与山东汉族人群哮喘发生无明显相关性。

高三尖杉酯碱白血病多药耐药细胞系K562/HHT的诱导及米非司酮逆转耐药的研究

目的:研究高三尖杉酯碱(HHT)诱导的白血病多药耐药细胞株耐药机制以及米非司酮(RU486)逆转其耐药效应。方法:采用反复短期暴露并逐渐增加HHT浓度的方法建立白血病多药耐药细胞系K562/HHT,MTT法检测K562/HHT细胞对化疗药物的敏感性及RU486对该细胞的细胞毒效应,RT-PCR法检测细胞MDR1基因、葡萄糖神经酰胺合成酶(GCS)基因的表达,流式细胞术检测细胞P-糖蛋白的表达和柔红霉素积累量,免疫组化法检测细胞Bcl-2、Bax、caspase-3的表达状况。结果:成功诱导出多药耐药细胞系K562/HHT,K562/HHT较其亲代细胞K562对HHT、阿霉素、长春新碱、依托泊苷的耐药性分别提高462.6、2.8、1183.4、2.6倍,K562/HHT细胞MDR1基因、GCS基因、P-糖蛋白和Bcl-2/Bax比值明显高于K562细胞(P<0.05),caspase-3表达、柔红霉素积累量明显低于K562细胞(P<0.05)。10μmol/L的RU486对K562/HHT细胞无明显杀伤(存活率94.67%±2.48%),该浓度RU486可不同程度地逆转K562/HHT细胞对上述化疗药物的耐药性,RU486作用后K562/HHT细胞caspase-3表达、柔红霉素积累量明显高于作用前(P<0.05),Bcl-2/Bax比值明显低于作用前(P<0.05)。结论:白血病细胞系K562在HHT的作用下可形成多药耐药细胞系K562/HHT,其耐药性的形成与P-糖蛋白、GCS、Bcl-2/Bax比值及caspase-3等机制有关,RU486可通过提高细胞内药物积累、调节Bcl-2/Bax比值和caspase-3的表达逆转此细胞的耐药性。

IL27p28基因启动子区域-964A>G位点多态性与中国汉族人群支气管哮喘的相关性

目的检测中国汉族人群IL-27p28基因启动子区域一个单核苷酸多态位点-964A>G的多态性,探讨该位点多态性与中国汉族人群支气管哮喘易感性的关系。方法采用聚合酶链式反应—限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法检测360例哮喘患者和220例正常对照者IL-27p28基因启动子区域单核苷酸多态位点-964A>G的基因型,计算基因型频率和等位基因频率,对比分析两组基因频率和基因型频率分布。结果IL-27p28基因启动子区域-964A>G位点在中国汉族人群中具有多态性,其基因频率与基因型频率分布在病例组和对照组中均符合Har-dy-Weinberg平衡,基因型AA、GA和GG的频率在病例组分别为0.402 8、0.420 5和0.172 2,在对照组中分别为0.431 80、.445 5和0.122 7;该位点的基因型频率及等位基因频率在病例组和对照组间的差异均无统计学意义(P=0.274),提示该多态位点与中国汉族人群哮喘无显著相关性。结论IL-27p28基因启动子区域单核苷酸多态-964A>G与中国汉族人群支气管哮喘易感性没有显著相关性。

COX-2在人膀胱移行细胞癌中的表达

目的:检测在人膀胱移行细胞癌(transitional cell carcinoma of bladder,BTCC)组织和正常膀胱组织中COX-2 mRNA和COX-2蛋白的表达,探讨COX-2在人BTCC中发生发展的作用。方法:应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫组织化学技术检测人BTCC和正常膀胱组织中COX-2 mRNA和COX-2蛋白的表达,并行统计分析。结果:RT-PCR检测13例新鲜BTCC组织COX-2mRNA均阳性表达,7例正常膀胱粘膜中无阳性表达,两者差异有统计学意义(P<0.01)。免疫组织化学研究结果与RT-PCR相似,COX-2蛋白主要集中在肿瘤细胞胞浆内,阳性表达率为55.74%,正常膀胱粘膜中没有表达。结论:COX-2 mRNA和蛋白在人BTCC组织中表达增高,COX-2蛋白的表达强度与肿瘤的分级和分期有关,表达强度随肿瘤恶性程度的增加而增加,说明COX-2可能在BTCC的发生发展中起着重要作用。

影响RNA剪接的基因变异

发现和正确解读疾病相关突变是遗传病分子诊断和临床指导的关键。尽管二代测序技术的应用显著改善了突变检测效率,但解读突变的生物学效应仍然存在挑战。目前对基因检测结果的解读更多地关注突变对蛋白质结构和功能的影响,而忽视了基因变异对RNA剪接的影响。越来越多的证据显示引起RNA剪接异常的基因变异在疾病发生中发挥重要作用。本文对影响RNA剪接的主要突变类型和确认方法进行介绍,以期为准确判断突变的遗传效应提供参考。

窄范围pH梯度干胶条可提高胃癌细胞蛋白质组表达谱分辨率

目的 探讨不同pH梯度干胶条在提高胃癌细胞蛋白质表达谱分辨率中的作用,为深入研究胃癌的蛋白质组学奠定基础.方法 提取胃低分化腺癌细胞MGC-803的蛋白质,分别采用pH 3～10和pH4～7不同pH梯度干胶条建立胃低分化腺癌细胞MGC-803蛋白质双向凝胶电泳图谱,与相对应pH区域的蛋白质斑点进行比较.结果 成功地构建出两种不同pH梯度MGC-803细胞的双向凝胶电泳图谱,经比较两种图谱蛋白质斑点结果显示,运用窄范围pH 4～7干胶条可更有效分辨出pH 3～10部分区域内聚积的蛋白质斑点.结论 采用窄范围pH的干胶条可提高双向电泳图谱分辨率,优化了胃癌细胞蛋白质组学研究的技术体系,可有效获取待测靶蛋白.

G蛋白偶联受体家族的发现和结构机理研究--2012年诺贝尔化学奖解读

2012年10月10日，2012年诺贝尔化学奖（The Nobel Prizein Chemistry）在瑞典皇家科学院揭晓，由于在G蛋白偶联受体研究领域（“forstudies of G-protein-coupledreceptors”）中的重要贡献，诺贝尔奖委员会宣布将诺贝尔化学奖授予两位美国生物化学家：霍华德·休斯医学研究所、杜克大学医学中心的罗们特·莱夫科维茨（Robert J．Lefkowitz）和斯坦福大学医学院的布莱恩·克比尔卡（BrianK．Kobilka）（图1）．

TNFSF4基因与冠心病的关联研究

TNFSF4(Tumor necrosis factor superfamily,number 4)基因是动脉粥样硬化的易感基因。但在瑞典、德国人群中进行的病例对照关联分析却得到了相反的结果。为探讨中国汉族人群中该基因与冠心病的关联性,从山东大学齐鲁医院选取了498例病例及509例对照,分析了TNFSF4基因上5个SNP位点(rs1234314、rs45454293、rs3850641、rs1234313、rs3861950)与冠心病之间的关联性。在采用传统的以单个SNP位点为单位以及以单体型为单位的统计分析方法的基础上,引进基于主成分的logistic回归分析方法进行处理。结果显示:Armitage趋势检验中只有rs3861950位点(P=0.0324)具有统计学意义,经Bonferroni多重检验校正后,5个SNP位点均无统计学意义;调整混杂因素的logistic回归分析中,5个SNP位点均无统计学意义;单体型分析中,CTAGT(P=0.0006)、CTAAC(P=0.0123)、CCAGT(P=0.0004)、GTGGT(P=0.0329)、GCGAC(P<0.0001)以及GCAAC(P=0.0173)这6个单体型在病例组和对照组中的频率差异具有统计学意义;基于主成分的logistic回归分析中,第一主成分具有统计学意义(P=0.0236)。结果表明,TNFSF4基因与冠心病之间存在关联性。

科研成果在教学中的转化研究--以代谢组学为例

代谢组学(metabonomic)是系统生物学研究的重要组成部分,已成为医学和生命科学领域的一新兴前沿研究热点。把前沿性代谢组学科研成果转化为实验教学的内容,在科学研究的基础上,优化并充实教学内容,实现科研与教学的有机互动,有利于教学水平和学生综合素质的提高。

敲除小鼠Ormdl3基因可部分缓解降植烷诱导的狼疮表型

目的探讨ORMDL3基因与系统性红斑狼疮(SLE)临床表型之间的关系。方法采用TALEN技术构建Ormdl3基因敲除小鼠。取纯合敲除小鼠(Ormdl3^-/-)与同窝野生小鼠(Ormdl3^+/+)各20只,分为4组,分别腹腔注射降植烷与PBS各0.5 mL,在注射3个月和6个月后比较各组小鼠24 h尿蛋白水平,HE染色比较肾脏损伤程度,称重比较脾脏质量、体质量,流式细胞术比较脾脏组织CD4^+/CD8^+T细胞比例。结果(1)注射降植烷3个月及6个月后,Ormdl3^-/-敲除小鼠脾脏肿大程度低于同时注射降植烷的Ormdl3^+/+野生小鼠;(2)Ormdl3^-/-敲除小鼠在注射降植烷6个月后,24 h尿蛋白水平较同样注射降植烷的Ormdl3^+/+野生小鼠差异无统计学意义(P=0.066);HE染色结果显示Ormdl3^-/-敲除小鼠在注射降植烷后肾脏损伤程度较注射降植烷的Ormdl3^+/+野生小鼠轻。(3)降植烷诱导的Ormdl3^+/+野生小鼠脾脏CD8^+T细胞比例下降(P<0.05),进而导致CD4^+/CD8^+T细胞比例升高(P<0.05),而Ormdl3^-/-敲除小鼠在注射降植烷后能够抵抗CD4^+/CD8^+T细胞比例上升的趋势。结论Ormdl3基因缺失可部分缓解降植烷诱导的狼疮小鼠模型表型程度,初步提示ORMDL3可能在导致SLE发病过程中具有一定作用。

山东汉族人群15-脂氧合酶-1基因多态性与冠心病易感性的相关性研究

目的探讨山东汉族人群中15-脂氧合酶-1基因(ALOX15)多态位点rs916055T>C与冠心病(CHD)的相关性。方法应用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态(PCR-RFLP)方法检测452例CHD患者和507例正常对照者rs916055T>C的基因型,探讨其与CHD的相关性。结果rs916055T>C基因型频率符合Hardy-Weinberg平衡定律。rs916055T>C的基因型以及等位基因频率在冠心病组和对照组间无统计学差异(P=0.398,P=0.183);而应用logistic回归分析调整了其他相关因素后,该位点基因型分布在两组间有统计学差异,等位基因C携带者(CC+CT)患冠心病的风险较TT纯合子增加了2.480倍(OR=3.480,95%CI:1.143-10.592,P=0.028)。根据冠状动脉造影结果对CHD患者进行分层分析发现,rs916055T>C与CHD严重程度无相关性。结论ALOX15的多态位点rs916055T>C可能与山东汉族人群CHD的易感性相关。

ETS1基因与中国北方汉族人群系统性红斑狼疮的相关性研究

目的验证ETSl基因在北方汉族人群系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）发生中的作用。方法应用病例一对照关联研究，在山东汉族人群中收集231例SLE患者和474名正常对照，采用Taqman探针对ETS1基因31非翻译区区域单核苷酸多态位点rsll28334与r84937333进行基因分型，并对数据进行统计学计算和单倍型分析。结果rsll28334等位基因A在病例组中的频率显著高于对照组（42．8％VS．29．1％，OR=1．824，95％CI：1．445-2．302，P〈0．01），rs4937333等位基因T在病例组中的频率显著高于对照组，差异具有统计学意义（47．6％VS．38．1％，OR=1．478，95％CI：1．181-1.851，P〈0．01）。两位点的单倍型分析显示单倍型A-T与SLE的发病风险显著相关（P〈0．05，OR=0．738，95％CI：0．564-0．964），而单倍型GC可以显著降低SLE的发病风险（P〈0．01，OR=0．296，95％CI：0．232-0．378）。结论ET51基因rsll28334和rs4937333位点与北方汉族人群系统性红斑狼疮相关。

米非司酮逆转K562/A02细胞多药耐药的研究

目的研究孕激素拮抗剂米非司酮对白血病多药耐药细胞 K562/A02的逆转作用及其机制。方法 MTT 法检测米非司酮作用72 h 后 K562/A02细胞增殖及其对阿霉素杀伤敏感性的变化;流式细胞术检测米非司酮作用前后 K562/A02细胞表面 P 糖蛋白的表达和细胞内柔红霉素的浓度;免疫组化法观察米非司酮作用前后 K562/A02细胞凋亡相关蛋白 bcl-2、Bax、caspase-3的表达;RT-PCR 检测米非司酮作用后对 K562/A02细胞内葡萄糖神经酰胺合成酶(GcS)mRNA 表达的影响。结果2.5、5.0和10.0μmol/L 米非司酮不抑制 K562/A02细胞的增殖,但上述浓度的米非司酮作用后K562/A02细胞对阿霉素的敏感性较前分别增强了1.68、4.17和10.71倍。K562/A02细胞表面 P 糖蛋白的表达为(49.03±5.32)%,10 μmol/L 米非司酮作用72 h 后降低到(28.60±2.13)%(P<0.01);K562/A02细胞内柔红霉素的浓度为(61.07±8.61)%,而10 μmol/L米非司酮作用后升高到(92.72±3.48)%(P<0.01)。经10 μmol/L 米非司酮作用后,bcl-2蛋白表达由(56±9)%降低到(37±6)%(P<0.05);Bax 蛋白由(40±5)%升高到(87±10)%(P<0.01);caspase-3蛋白则由(36±7)%升高到(89±6)%(P<0.01)。RT-PCR 结果显示 K562/A02细胞 GcS mRNA 的表达较K562细胞明显升高,10 μmol/L 米非司酮能明显降低 K562/A02细胞内 GcS mRNA 的表达。结论米非司酮可逆转白血病 K562/A02细胞的多药耐药,且具有剂量依赖性。10 μmol/L 米非司酮能明显逆转白血病 K562/A02细胞的多药耐药,其机制与降低 P 糖蛋白的水平,调节凋亡相关蛋白 bcl-2、Bax、caspase-3的表达,降低 GcS mRNA 有关。

遗传性痉挛性截瘫的分子遗传学研究进展

遗传性痉挛性截瘫（hereditary spastic paraplegia，HSP）义称Strumpell—Lorrain病，最早于19世纪由Strumpell（1880年）和Lorrain（1898年）报道，是一组较罕见的具有高度临床和遗传异质性的神经系统遗传性疾病。HSP属于神经系统变性疾病，临床表现主要为进行性加重的痉挛步态、双下肢肌张力增高、腱反射亢进、踝阵挛、病理征阳性、肌无力等，可伴有膀胱直肠功能异常、踝关节振动觉减退、弓形足等。

人副流感病毒3型HN糖蛋白N-糖链的功能研究

为了研究人副流感病毒3型(hPIV3)HN糖蛋白N-糖链的功能,采用基因定点突变技术构建糖基化位点突变体,然后检测各突变株的蛋白电泳速率、细胞表面表达量、受体结合活性、神经氨酸酶活性和促细胞融合活性。HN分子的G1、G2、G3和G4 4个糖基化位点分别和联合突变后发现G1、G2和G4及其联合突变株(G12、G14、G24和G124)电泳速率加快,而G3突变株电泳速率没有变化。各突变株的表达效率,神经氨酸酶活性与野毒株相比差别无统计学意义(P>0.05),但受体结合活性和促细胞融合活性均有不同程度的降低(P<0.05)。G1、G2和G4位点突变后受体结合活性分别为突变前的83.94%、76.45%和55.32%,而促细胞融合活性降为突变前的80.84%、77.83%和64.16%。联合突变株G12、G14、G24和G124血吸附活性进一步降低,为突变前的33.07%、20.67%、19.96%和15.11%,促细胞融合活性进一步降低为突变前的46.36%、12.04%、13.43%和4.05%。结果表明:hPIV3HN糖蛋白的糖链对HN糖蛋白的受体结合活性和促细胞融合活性有重要影响,推断糖链的丢失可能会引起HN糖蛋白头部结构(受体结合活性位点所在区域)或者方向的改变或者无法与宿主细胞膜表面的凝集素受体(一种与N-糖链结合的受体)结合,进而导致受体结合活性和促细胞融合活性的降低。

一个X连锁腓骨肌萎缩症家系的临床和分子遗传学分析

目的分析1个x连锁腓骨肌萎缩症家系的临床特点及分子遗传学病因。方法对先证者及其家系成员进行详细的临床检查。采集家系成员的外周血并提取基因组DNA，应用PCR结合直接DNA测序分析GJB1基因的突变。结果该腓骨肌萎缩家系为x连锁遗传。在该家系中GJB1基因错义突变C．614A〉G（P．Asn205Ser）与表型共分离。结论GJB1基因错义突变c．614A〉G（p．Asn205Ser）是导致该x连锁腓骨肌萎缩症家系致病的原因。

ABCG1基因两个单核苷酸多态位点与冠状动脉粥样硬化性心脏病易感性及病情严重程度的相关性分析

目的 应用基于群体的病例-对照关联研究方法探讨ABCG1基因上的遗传多态性与冠状动脉粥样硬化性心脏病（简称冠心病）及病情严重程度的相关性.方法 在山东汉族人群中收集541例冠心病患者和649名正常对照,采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态方法对ABCG1基因内两个单核甘酸多态位点进行基因分型,统计学分析.结果 rs225374等位基因C在病例组中的频率显著高于对照组（OR=1.186,95%CI：1.009～1.394,P=O.039）,在男性病例组与对照组中的差异同样具有统计学意义（OR=1.236,95%CI：1.014～1.506,P=O.036）.rs1044317等位基因A在病例组中的频率显著高于对照组（OR=1.187,95%CI：1.009～1.397,P=0.039）.单独在病例组内的分析结果显示,rs225374等位基因C频率在高Gensini积分组中显著高于低Gensini积分组（OR=1.303,95%CI：1.024～1.657,P=O.031）.结论 ABCG1基因上两个单核苷酸多态位点与冠心病易感性及病情严重程度具有一定相关性.

汉坦病毒GM04-38株N-联糖基化位点在细胞融合中作用的初步确定

目的初步确定汉坦病毒GM04—38株N-联糖基化位点在细胞融合中的作用。方法采用基因定点突变技术将汉坦病毒GM04-38株G1片段上N134、N235、N347、N399四位点及G2片段上N928位点共5个位点上的天冬酰胺置换为丙氨酸。转染VeroE6细胞后，间接免疫荧光（IFA）检测蛋白表达，荧光显微镜观察IFA结果；Westernblot检测蛋白的表达情况。采用Giemsa染色法观察细胞融合现象。结果在VetoE6细胞中成功表达出糖蛋白，Westernblot显示除134位点末显示G1片段外，各突变体均表达出G1、G2片段。IFA显示天冬酰胺突变前后各位点均显示荧光信号，呈核周分布。突变后134位点与928位点的突变体融合现象消失，其余各位点突变后融合现象仍然存在。结论G1上的134位点可能与蛋白正确折叠有密切关系，134位点突变极可能导致蛋白的错误折叠，进而无法转运出内质网。G2上的928位点对细胞融合有重要作用，提示汉坦病毒融合肽很有可能位于G2上。

常染色体显性遗传并多指一家系致病基因分析及产前诊断

目的分析常染色体显性遗传并多指（synpolydactyly，SPD）一家系的致病基因，为家系成员提供遗传咨询和产前诊断。方法临床诊断依据患者的临床特征和手足X线检查结果；致病基因分析采用候选基因分离策略，通过连锁分析确定该家系致病基因与已知SPD致病基因的连锁关系，PCR扩增HOXDl3基因检测基因突变。于孕16～21周对家系中高危妊娠的胎儿行超声诊断，并抽取孕妇羊水提取胎儿脱落细胞DNA进行连锁分析和突变检测验证。结果临床特征和家系分析表明该家系符合典型的常染色体显性SPD特征；连锁分析表明位于HOXDl3基因两侧的D2S1238、D2S1245两个短串联重复序列位点与该家系致病基因呈紧密连锁状态。家系患者的HOXDl3基因编码的聚丙氨酸链中丙氨酸残基由正常的15个延伸为24个，HOXDl3基因为该家系的突变基因。超声诊断提示妊娠胎儿正常，连锁分析和突变检测也证实胎儿不携带HOXDl3基因突变。结论HOXDl3基因为该先天性并多指（趾）家系的致病基因；联合使用B超和基因诊断方法可为患者提供准确的产前诊断。