α-乙酰乳酸脱羧酶的基因克隆及在大肠杆菌和酿酒酵母中的表达

以ｐＵＣ１９质粒为载体，以Ｅ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９为受体，构建了含α一乙酰乳酸脱羧酶（α－ＡＬＤＣ）基因的地衣芽孢杆菌 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ＡＳ１０１０６的基因文库，得到４８００个重组转化子中均含有４～１０ｋｂ的外源插入ＤＮＡ片段。从基因文库中筛选到６个阳性克隆，对其中１个克隆的α－乙酰乳酸脱羧酶基因片段进行亚克隆分析表明，该α－乙酰乳酸脱酶基因位于１．６ｋｂ的ＢａｍＨＩ－ＥｃｏＲＩ片段上。对其研究发现，α－乙酰乳酸脱酶基因在大肠杆菌中表达产生的乙酰乳酸脱羧酶在最适反应温度和ｐＨ值等与供体菌的酶活相当。利用大肠杆菌和酵母菌穿梭质粒ｐＹＥＳ２为载体，可以将α－乙酰乳酸脱羧酶基因引入酿酒酵母中，从而使重组酵母菌株具有降解啤酒发酵中生成的α－乙酰乳酸，减少双乙酰含量的能力。

酿酒酵母两种不同嗜杀菌株的比较研究

以酿酒酵母两种不同类型的嗜杀菌株SK4（K1型）和ERRI（K2型）为材料，分析了不同嗜杀酵母的嗜杀特性，两株嗜杀酵母具有相互杀死作用，其嗜杀活性与菌体生长有关。SK4和ERRI的嗜杀质粒的比较表明：M1－dsRNA质粒和M2-dsRNA质粒分子量分别为1．7kb和1．5kb，两株菌的L－dsRNA质粒均为4．0kb。用高温和紫外线处理嗜杀酵母，嗜杀活性随之消失，消除菌中的M－dsRNA质粒也相应消失，嗜杀活性的消除率随菌株和消除剂的不同而变化。实验证明两株菌产生的毒素蛋白的最适嗜杀作用条件不同，最适pH和温度分别为4．8、16℃和4．0、22℃，但两种毒素蛋白均对在对数生长期的敏感细胞作用最显著。

人免疫缺陷病毒1(HIV-1)膜蛋白基因片段在酵母中的克隆表达

目的为获得足够量的膜糖蛋白，以便于对不同ＨＩＶ分离株膜糖蛋白的结构与功能进行进一步的研究。方法从人免疫缺陷病毒１（ＨＩＶ－１）ＨＸＢ２分离株原病毒基因组的重组质粒ｐＨＸＢ２中克隆了两段膜糖蛋白基因（ＥＮＶ）片段。以酵母穿梭诱导表达质粒ｐＹＥＳ２为载体，构建了两个相应的重组表达质粒ｐＹＥＮＶ１和ｐＹＥＮＶ２；进一步利用大肠杆菌β－半乳糖苷酶基因（β－ｌａｃＺ）构建了ＨＩＶ－１膜外糖蛋白ＤＮＡ片段与β－ｌａｃＺ基因的融合表达质粒。将此３种质粒分别转化单细胞真核生物酿酒酵母ＢＪ１９９１，得到的转化子经半乳糖诱导表达后进行菌体全蛋白的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。结果克隆的基因片段在酿酒酵母中产生了分子质量为５０×１０３的特异性诱导蛋白；对含此融合表达质粒的酵母转化子半乳糖诱导后表达产物的免疫检测表明，与对照菌株相比，融合表达产物具有和ＨＩＶ－１阳性血清抗体反应的抗原性。结论可通过β－半乳糖苷酶活性的测定直接指示抗原片段的表达；