抑制核因子-κB对人眼角膜基质细胞分泌细胞因子的影响

目的观察体外抑制核因子-κB(NF-κB)对人眼角膜基质细胞分泌细胞因子的影响。方法四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测不同浓度的大黄素对人眼角膜基质细胞活性的影响。用脂多糖(LPS)刺激体外培养的基质细胞,将细胞分为正常对照组(n=6)、LPS组(n=24)和大黄素组(n=24)。LPS组单纯给予LPS刺激,大黄素组于LPS刺激前先用大黄素预处理30min,其余处理同LPS组。分别用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和酶联免疫吸附实验(ELISA)检测LPS刺激对角膜基质细胞白细胞介素8(IL-8)基因表达和蛋白分泌的影响,Westernblotting检测角膜基质细胞中κB抑制因子α(IκB-α)蛋白的表达。结果所用浓度大黄素对体外培养的角膜基质细胞活性无影响。与刺激前相比,LPS刺激可引起人眼角膜基质细胞IL-8mRNA表达增加,促进IL-8蛋白分泌、下调细胞内IκB-α蛋白水平,P<0.01差异均有统计学意义。大黄素预处理可明显抑制LPS诱导的人眼角膜基质细胞表达IκB-α,下调细胞IL-8基因表达,减少IL-8蛋白分泌,明显低于同时间点LPS组的表达,P<0.01差异具有统计学意义。结论LPS可引起人眼角膜基质细胞IκB-α的降解,促进NF-κB核转位,引起IL-8表达。体外抑制NF-κB,能减少人眼角膜基质细胞分泌IL-8。

大黄素对脂多糖诱导的角膜基质细胞表达细胞因子的影响

目的观察大黄素对脂多糖(LPS)诱导的角膜基质细胞表达细胞因子的影响。方法原代培养角膜基质细胞,选取第4代细胞进行实验。根据在LPS刺激角膜基质细胞前是否先用40μmol/L大黄素培养细胞30 min,将细胞分为大黄素+LPS组和LPS组,分别在10μg/LLPS刺激角膜基质细胞前以及刺激后1、2、4、8 h收集细胞;或先用0、5、10、20和40μmol/L的大黄素培养细胞30 min后,再用10μg/L LPS刺激8 h。Western blot检测角膜基质细胞κB抑制因子-α(IκB-α)蛋白的表达;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测角膜基质细胞白细胞介素(IL)-6和IL-8的mR-NA表达。结果LPS刺激角膜基质细胞后1、2、4、8 h,细胞表达IκB-α蛋白均较刺激前明显下降(P<0.01);大黄素对LPS引起的角膜基质细胞IκB-α蛋白的降解有不同程度的抑制作用,且该作用呈一定的浓度依赖性(P<0.05)。LPS刺激引起角膜基质细胞IL-6和IL-8 mRNA表达升高,刺激后各时间点IL-6和IL-8 mRNA表达均较LPS刺激前明显升高,呈一定时间依赖性(P<0.01);大黄素对LPS诱导的角膜基质细胞IL-6和IL-8 mRNA表达有明显抑制作用,且该作用呈一定浓度依赖性(P<0.05)。结论大黄素能抑制体外培养的角膜基质细胞表达IL-6和IL-8,可能与其抑制IκB-α降解、促进NF-kB活化有关。

人骨髓间充质干细胞体外分化为结膜上皮样细胞

目的探讨体外诱导人骨髓基质干细胞(hMSCs)向结膜上皮样细胞(hCjEs)定向分化的可能性。方法体外分离、培养hMSCs和人hCjEs,分别从细胞形态学和免疫细胞化学的方法对细胞进行鉴定;Transwell非接触共培养法诱导hMSCs向结膜上皮样细胞定向分化;倒置相差显微镜观察分化细胞的形态学改变;免疫细胞化学和反转录聚合酶链反应分别对分化细胞角蛋白13(CK13)的蛋白和mRNA表达进行检测;并用单独培养的hMSCs和hCjEs做对照。结果实验获取的hMSCs以长梭形为主,融合呈漩涡状;hCjEs呈不规则圆形或多边形,融合的hCjEs成铺路石样;hMSCs阳性表达CD44和CD29,hCjEs阳性表达CK13;非接触共培养使hMSCs的形状由长梭形逐渐变为不规则多边形;免疫细胞化学和RT-PCR分别在蛋白和基因水平证实分化细胞表达CK13,与单独培养的结膜上皮细胞表达相似。结论在一定条件下,可以诱导体外培养的hMSCs形态发生变化、向具有结膜上皮细胞表型的上皮样细胞定向分化。

大黄素对急性角膜炎症反应中ICAM-1表达的影响及意义

目的观察大黄素对急性角膜炎大鼠角膜组织中细胞间粘附分子-1(ICAM-1)表达的影响及意义。方法建立角膜炎大鼠模型,模型制备前30 min,大鼠结膜下分别注射大黄素(治疗组)及等容二甲基亚砜(炎症组)。按脂多糖(LPS)刺激后不同时点,各组又分为1、3、6、122、4 h组,每亚组8只鼠。于各时点观察大鼠的全身情况,裂隙灯显微镜观察大鼠结膜、角膜及房水等眼部表现;抽取大鼠房水涂片,HE染色观察房水细胞的变化;角膜组织切片,HE染色观察各组大鼠角膜的组织形态学改变;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测大鼠角膜组织中ICAM-1 mRNA的表达。结果球结膜下预防性注射大黄素,可明显改善角膜炎大鼠畏光、流泪等眼部表现,减轻角膜混浊、组织水肿等炎症反应。大黄素预处理可明显减轻大鼠角膜组织及房水中炎症细胞浸润的程度,改善角膜组织水肿及角膜基质层胶原纤维排列的紊乱程度。LPS刺激可引起炎症组大鼠角膜组织中ICAM-1mRNA表达增加,该作用可被大黄素部分抑制,治疗组各时点ICAM-1 mRNA的表达较炎症组均明显降低(P均<0.01)。结论大黄素可减少急性角膜炎症反应中ICAM-1 mRNA的表达,对急性角膜炎大鼠角膜损伤起保护作用。

脂多糖诱导人角膜基质细胞核因子-κB的活化表达及意义

目的研究脂多糖(LPS)诱导人角膜基质细胞核因子-κBp65(NF-κBp65)和NF-κB抑制因子-α(IκB-α)的表达及意义。方法原代培养人眼角膜基质细胞,用免疫细胞化学SABC方法进行细胞鉴定。采用绿脓杆菌LPS刺激角膜基质细胞,分别于刺激前(0 h),刺激后1、2、4、8 h收集细胞。Western blot检测胞浆内IκB-α蛋白及胞核内NF-κBp65蛋白的表达。结果与0 h相比,LPS刺激细胞1 h时,即可检测到胞核内NF-κBp65蛋白表达增加,其电泳条带的光密度值随着刺激时间的延长而逐渐变亮,4 h表达最高。LPS刺激细胞后各时点的NF-κBp65蛋白表达与0 h组比较,差异有统计学意义(P均<0.01)。LPS刺激角膜基质细胞后,在各时间点均可引起胞浆IκB-α表达下降,4 h时表达最低(P均<0.01)。结论LPS可引起人眼角膜基质细胞IκB-α的降解,促进NF-κB的核转位,在角膜炎的过程中可能起一定的抗炎作用。

大黄素对角膜基质细胞分泌细胞因子的干预作用

目的观察大黄素对体外培养的人眼角膜基质细胞分泌白细胞介素6(IL-6)的干预作用。方法四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测不同浓度大黄素对人眼角膜基质细胞活性的影响。绿脓杆菌脂多糖(LPS)刺激角膜基质细胞(LPS组),并用大黄素进行干预(大黄素预处理组)。分别于LPS刺激前(0h),刺激后1、2、4、8h收集各组细胞及细胞上清液。Western blot检测不同时点角膜基质细胞κB抑制因子-α(IκB-α)蛋白的表达及大黄素的作用,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测不同时点角膜基质细胞IL-6蛋白的分泌及大黄素的作用。结果不同浓度大黄素对角膜基质细胞的活性没有影响。与0h相比,LPS刺激角膜基质细胞1h时,胞浆IκB-α蛋白表达出现下降,其电泳条带随着刺激时间的延长而逐渐变暗,4h时最暗。LPS刺激后各时点IκB-α蛋白表达较LPS刺激前均明显下降(P<0.01)。LPS刺激可引起人眼角膜基质细胞IL-6蛋白分泌增多,刺激后8h达峰值,LPS刺激细胞后各时点细胞分泌IL-6均较刺激前明显增加(P<0.01)。大黄素预处理后,与LPS组相比较,角膜基质细胞表达IκB-α蛋白下降、细胞分泌IL-6减少(P<0.01)。结论绿脓杆菌LPS可引起人眼角膜基质细胞IκB-α降解,引起细胞因子表达,在角膜炎的过程中可能起一定的作用。大黄素能有效抑制LPS诱导的人角膜基质细胞IκB-α降解,从而减少相应细胞因子的分泌。