核转录因子-κB通路在CD40-CD154诱导血管内皮细胞活化中的作用

目的探讨血管内皮细胞（VEC）内核转录因子-κB（NF-κB）通路在CD40-CD154相互作用诱导VEC活化中的作用。方法应用重组人肿瘤坏死因子α（rhTNF-α）和重组人γ干扰素（rhIFN-γ）刺激人主动脉VEC，通过流式细胞仪（FACS）检测CD40和粘附因子表达水平；通过表达CD154的细胞株D1．1和VEC共同培养后，观察VEC粘附因子的表达水平；通过抗CD154单克隆抗体阻断CD40-CD154间的反应；应用NF-κB阻断剂BAY11-7082观察阻断NF-κB通路后对CD40-CD154诱导VEC活化的影响。结果未活化的VEC膜表达低水平的CD40、CD54和CD106，但不表达CD62E，经白细胞介素刺激后可上调这些蛋白分子的表达水平。D1．1细胞株和VEC共同培养后可诱导VEC活化并上调CD62E、CD54和CD106的表达水平；抗CD154抗体可阻断CD40-CD154间的反应所诱导的VEC活化；NF-κB阻断剂可阻断rhTNF-α诱导的VEC活化以及CD40-CD154间的反应所诱导的VEC活化。结论VEC中CD40和T淋巴细胞中CD154之间的相互作用在诱导VEC活化过程中起重要作用；CD40-CD154相互作用并通过NF-κB通路诱导VEC活化；NF-κB通路阻断剂可抑制VEC活化。

同种异体单核细胞活化血管内皮细胞产生IP-10、I-TAC的体外研究

目的研究单核细胞对异体血管内皮细胞(VEC)的活化作用以及产生干扰素诱导蛋白10(IP-10)、干扰素诱导的T细胞α型趋化因子(I-TAC)的效果。方法人外周血中分离单核细胞,酶消化法分离人主动脉内皮细胞,建立单核细胞与VEC共培养系统。用流式细胞仪(FACS)检测VEC表面粘附分子CD54、CD62E表达的情况,用RT-PCR检测VEC内I-TAC和IP-10mRNA的表达情况。结果 RT-PCR检测结果表明,VEC与同种异体单核细胞共培养24h后,细胞内IP-10和I-TACmRNA表达水平显著增加(P<0.05),且在48、72h的表达维持在较高的水平。FACS检测结果表明,正常培养的VEC少量表达CD54分子,不表达CD62E分子。与同种异体单核细胞共培养24h后,VEC表面CD62E和CD54的表达水平明显上调(P<0.05)。结论在同种异体单核细胞-血管内皮细胞免疫反应中,单核细胞能活化血管内皮细胞,使内皮细胞表达IP-10、I-TAC等趋化因子和CD54、CD62E等粘附分子,参与对移植器官的排斥反应。

RATG对CD4^＋细胞和CD8^＋细胞共刺激分子基因表达和细胞因子分泌的影响

目的探讨兔抗人胸腺细胞多克隆抗体（RATG）在体外对CD4^＋细胞和CD8^＋细胞共刺激分子基因表达和细胞因子分泌的影响。方法从正常成人外周血单个核细胞中分离和纯化CD4^＋细胞和CD8^＋细胞，加入RATG，37℃下培养，分别于24、48和72h收集培养上清液和细胞，以不处理的细胞为正常对照，正常兔1g处理的细胞作为阴性对照。采用实时聚合酶链反应技术检测培养细胞的细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA4）、CD154、Foxp3、OX40、γ干扰素（IFN-γ）、白细胞介素2（IL-2）、IL-10和IL-2受体（CD25）的基因表达水平，应用Multiplex检测技术测定培养上清液中IFN-γ、IL-2、IL4和IL-10的水平。结果与正常CD4^＋细胞比较，加入RATG的CD4^＋细胞培养24h，其CTLA-4、CD154、Foxp3、OX40、IFN-γ、IL-2、IL-10和CD25基因转录表达均上调，阴性对照CD4^＋细胞则无这些基因转录表达的上调。处理48h后，CD4^＋细胞的CD154和IL-2的基因转录表达呈现下调现象，而CTLA4、Foxp3、OX40、IFN-γ、IL-10和CD25的基因转录水平均较24h时明显降低。处理72h后，CD4^＋细胞的CTLA4、Foxp3、OX40和CD25的基因转录表达再次呈现高水平，CD154和IFN-γ的基因转录表达上调表达不明显，而IL-2和IL-10的基因转录表达则呈现明显的下调。RATG处理的CD4^＋细胞培养上清液中的IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10浓度显著增加，以处理24h的水平最高，而阴性对照者未测出。与正常CD8^＋细胞相比较，加入RATG处理的CD8^＋细胞培养24h，其CTLA4、Foxp3、OX40、IFN-γ、IL-2、IL-10和CD25的基因转录表达呈现明显上调，而CD154基因转录表达稍有下调。RATG处理48h，CD8^＋细胞的CTLA4、Foxp3、OX40、IFN-γ和CD25基因转录表达仍维持在高水平，CD154基因转录表达仅仅呈现低水平的上调，IL-10基因转录表达水平显著下降，而IL-2的基因转录表达则明显下调。处理72h，CD8^＋细胞的CTLA4、Foxp3、OX40、IFN-γ、IL-10和CD25的基因转录表达仍维持在高水平，CD154基因转录表达则呈现下调，而IL-2基因转录表达的下调更为显著。阴性对照CD8^＋细胞则未呈现这些基因转录的上调现象。RATG处理的CD8^＋细胞培养上清液中IFN-γ、IL-2和IL-10显著增多，以处理24h的浓度最高，IL-4浓度升高的幅度较小，而正常CD8^＋细胞和阴性对照CD8^＋细胞几乎检测不到IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10。结论在体外，RATG可以刺激CD4^＋细胞和CD8^＋细胞上调多种促进免疫抑制的共刺激分子基因表达，促进其分泌与免疫调节相关的IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10。

人单核细胞共刺激分子在异种免疫反应中的表达及其作用机制

目的揭示人单核细胞共刺激分子在异种免疫反应中的表达及其作用机制。方法从猪的主动脉分离血管内皮细胞（PEC）并培养扩增；从人单个核细胞（PBMC）中纯化CD4^＋T淋巴细胞和单核细胞。建立PEC和人PBMC混合培养体系，培养后收集细胞，然后加入荧光标记的单克隆抗体，通过流式细胞术检测CD14^＋单核细胞表面共刺激分子表达情况。为了检测淋巴细胞增殖反应以及阻断共刺激分子对PEC免疫反应的作用，在PEC和人PBMC混合培养体系中分别加入抗CD154、CDS0和CD86单克隆抗体，在培养的最后24h加入同位素，于培养结束后收集细胞并经同位素计数仪进行检测。纯化的单核细胞经PEC刺激后与CD4-T淋巴细胞共培养来研究这些单核细胞诱导CD4-T淋巴细胞的增殖以及阻断共刺激分子的作用。结果PEC和人PBMC混合培养后可检测到PBMC对异种PEC的高度免疫增殖反应；流式细胞术检测到PBMC中的CD14^＋单核细胞表面无CD40和CDS0的表达，但表达CD86，经PEC刺激后，CD14^＋单核细胞膜表面显著上调CD40和CD80蛋白分子的表达，CD86表达上调。与未经刺激的单核细胞相比较，经PEC刺激后的单核细胞和CD4^＋T淋巴细胞共培养后可诱导CD4^＋T淋巴细胞明显增殖，抗人CD154、CD80、CD86单克隆抗体可以阻断CD4^＋T淋巴细胞对PEC的增殖反应。结论人CD14^＋单核细胞在异种免疫反应过程的间接抗原提呈和共刺激信号传导中发挥重要作用，通过上调其共刺激分子的表达与CD4^＋T淋巴细胞共刺激分子CD154和CD28相互作用形成第二信号，并诱导CD4-T淋巴细胞对PEC的增殖反应；阻断共刺激分子可抑制异种细胞免疫反应。

单核细胞诱导同种异体血管内皮细胞产生干扰素诱导T细胞α型趋化因子的作用机制

目的研究外周血单核细胞与同种异体血管内皮细胞(VEC)反应产生干扰素诱导蛋白10(IP-10)和干扰素诱导的T细胞α型趋化因子(I-TAC)生成的机制。方法单独培养的VEC培养液中加入外源性TNF,用Multiplex技术检测上清液中IP-10、I-TAC浓度的变化;外周血单核细胞与同种异体VEC单独培养或共培养,检测上清液中趋化因子以及TNF浓度的变化;单核细胞和VEC共培养液中加入抗TNF抗体或核因子(NF)-κB通路阻断剂BAY11-7082干预免疫反应,观察对趋化因子生成的影响。应用实时PCR技术检测单核细胞与VEC共培养前后细胞内TNF、IP-10、I-TAC基因表达的变化。结果外源性TNF可刺激VEC产生IP-10、I-TAC;单核细胞、VEC单独培养只产生微量的IP-10、I-TAC,共培养24、48、72h后上清液中TNF以及IP-10、I-TAC浓度逐渐升高,细胞内TNF、IP-10、I-TACmRNA表达水平也显著增加;加入抗TNF抗体或BAY11-7082能消除单核细胞和VEC共培养导致的趋化因子生成。结论在同种异体单核细胞与VEC免疫反应中,单核细胞活化后产生TNF,再通过NF-κB信号通路刺激VEC产生IP-10、I-TAC等趋化因子,应用TNF抗体以及NF-κB信号通路阻断剂能减少IP-10、I-TAC等趋化因子的生成。