质粒表达载体pIRES-CD的构建及其在ACC-2细胞中的表达

目的:克隆大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD)基因,构建质粒表达载体pIRES-CD,并利用该载体转染ACC-2细胞,建立稳定表达大肠杆菌CD基因的ACC-2细胞克隆。方法:通过PCR从大肠杆菌DH5αDNA中扩增出CD基因全长序列,将扩增产物定向插入到克隆载体pMD18-T中,进行序列测定。测序正确后,将其亚克隆到质粒表达载体pIRES中,构建以内部核糖体进入位点(IRES)相连的CD基因的质粒表达载体pIRES-CD,采用电穿孔法,以质粒表达载体转染ACC-2细胞,用400μg/mL的G418筛选10d,获得稳定表达CD基因的ACC-2细胞系,提取该细胞的总RNA,用RT-PCR检测CD基因的表达。结果:PCR扩增出1280bp大小的片段,测序结果与GeneBank报道的CD序列基本一致;阳性重组质粒pIRES-CD经XbaI和NotI双酶切后,获得6.1kb和1280bp的片段;RT-PCR从转染细胞的总RNA中扩增出228bp的预期片段。结论:成功扩增了CD基因的DNA片段;成功构建了质粒表达载体pIRES-CD;建立了稳定表达CD基因的ACC-2细胞系,为CD/5-FC自杀基因系统在腺样囊性癌基因治疗中的应用奠定了基础。