Red/ET同源重组介导的基因克隆载体pBACS的构建、鉴定与应用

目的通过Red/ET同源重组技术构建pBACS基因克隆及测序质粒载体。方法以质粒pBAC2015、pET28a为模板设计四对引物,PCR扩增得到四段彼此间有50 bp同源区域的基因片段,分别命名为bac-sop、bac-ori、bac-kan和bac-T7。利用Red/ET同源重组技术,将四段基因片段电转至E.coli GB05-dir感受态中进行线线重组。经酶切、测序验证阳性克隆质粒。此外,对重组质粒pBACS进行稳定性鉴定;利用pBACS分别进行细菌16S rDNA和真菌ITS基因克隆和基因测序。结果酶切和测序的验证结果显示,质粒的大小、元件方向及序列正确;pBACS具有较强的稳定性,适用于作为基因工程的克隆载体;可高效用于细菌16S rDNA和真菌ITS序列的克隆,阳性率为100%。结论成功利用Red/ET技术构建克隆载体pBACS,质粒载体具有稳定性强、重组效率高的特点,在基因克隆和基因测序等方面具有良好的应用潜力。