重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白工程菌的高密度发酵

重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白(TNHH)是治疗用生物制品Ⅰ类新药,具有多种功效,可用于治疗脑卒中。本文旨在优化TNHH工程菌发酵工艺,以实现该工程菌的高密度发酵和目的蛋白的高效表达。笔者采用摇瓶试验和发酵罐发酵,从培养基碳、氮源配比正交试验入手,对工程菌生长和目的蛋白表达影响较大的单因子条件进行重点考察,如温度、pH、诱导策略、诱导剂和抗生素替代及补料流加方式。通过优化,6批50 L发酵工艺稳定,菌体密度(OD 600)均能达79以上,目的蛋白表达量均在30%以上,质粒丢失率均低于10%。优化后的发酵工艺稳定,产量提高258%,质粒丢失率保持在10%以内,为TNHH项目进一步大规模生产奠定了基础。

高效液相色谱法测定司美格鲁肽原料药中游离脂肪酸侧链的含量

目的建立高效液相色谱法检测司美格鲁肽原料药中的游离脂肪酸侧链[(S)-9,18,23-三氧代-2,5,11,14-四氧杂-8,17,22-三氮杂三十九烷-1,21,39-三羧酸]的含量。方法采用Kinetex C8(4.6 mm×150 mm,2.6μm)色谱柱;流动相A为0.1%三氟乙酸-水溶液;流动相B为0.1%三氟乙酸-乙腈溶液;洗脱梯度(0 min,30%B;20 min,70%B;21min,30%B;30 min,30%B),流速0.7 mL·min^(-1);柱温35℃;检测波长210 nm。考察方法的专属性、线性范围、定量限与检测限、准确度和耐用性等。采用该方法检测3批司美格鲁肽原料药中的游离脂肪酸侧链含量。结果脂肪酸侧链与司美格鲁肽的分离度为4.05,在1.00~50.15μg·mL^(-1)与峰面积呈良好的线性关系,回归方程为Y=0.2584X-0.0936,R^(2)=0.9999;检测限和定量限分别为0.392μg·mL^(-1)和0.784μg·mL^(-1)。结论建立的方法具有良好的专属性和准确度,可用于司美格鲁肽原料药中游离脂肪酸侧链含量的测定。

发酵条件对毕赤酵母高密度表达地特胰岛素前体DesB30的影响

地特胰岛素是目前市场上应用于糖尿病临床治疗的长效胰岛素之一,其前体普遍存在表达量低、成本较高等问题。本文中,笔者采用毕赤酵母分泌表达可溶性的地特胰岛素前体,拟通过优化发酵条件提高地特胰岛素前体DesB30的表达量。在高密度发酵条件下,对地特胰岛素前体DesB30的表达进行小试发酵条件的优化,使用5 L玻璃发酵罐进行发酵实验,分别选取pH、温度、诱导前菌体浓度和甲醇流加速度4个因素进行单因素实验,以考察DesB30的最适发酵条件。结果表明:DesB30的最适发酵条件为pH 6.0~6.5,诱导温度26℃,诱导前菌体质量浓度200 g/L,甲醇终流加速度16.3 mL/(h·L)。在确定的最优发酵条件下,DesB30表达量高达2.5 g/L左右,比以往有了显著提升,为后续大规模工业化生产提供了实验基础。

聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子工作对照品的制备和标定

目的 制备聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子(PEG-rhG-CSF)工作对照品,替换现有的rhG-CSF国家标准品,用于蛋白质含量、理化指标等测定.方法 按2015年版《中国药典》四部有关要求,进行工作对照品的制备、分装、冻干、质量检测、结构表征、活性测定.并采用凯氏定氮法进行蛋白质含量标定.结果 制备的工作对照品各项检测指标均符合标准,结构确证与理论相符,凯氏定氮协作标定结果:蛋白质含量为1.9339 mg/支,标准差为0.02295 mg/支,RSD=1.19%,符合统计学要求.结论 该批PEG-rhG-CSF工作对照品各项指标均符合要求,可用于鉴别、蛋白含量测定、各项纯度检查等日常检验和质量研究.

注射用重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白处方的筛选及优化

目的 对注射用重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白(human recombinant neutrophil inhibitory factor and hirulog hybrid,TNHH)的处方及工艺进行筛选和优化,并考察其稳定性。方法 以单因素试验结果为依据,pH范围、甘露醇用量、聚维酮K30用量为自变量,高分子蛋白含量为响应值,采用CCF响应曲面设计试验,分析各自变量及其交互作用对注射用重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白中高分子蛋白含量的影响,筛选出最优处方。为了方便操作,对最优处方调整后制备中试规模3批样品,分别置于40℃、相对湿度(relative humidity,RH)75%条件下2、4周,2~8℃条件下3、6个月,取样,检测外观、pH、反相高效液相色谱(reversed phase-high performance liquid chromatography,RP-HPLC)纯度和体积排阻高效液相色谱(size exclusion chromatography-high performance liquid chromatography,SECHPLC)纯度,验证该处方和工艺的稳定性。结果 筛选出的最优处方为:pH 4.982 6,甘露醇用量7.986 4%,聚维酮K30用量1.902 7%,最终调整为pH 5.0,甘露醇用量8.0%,聚维酮K30用量2.0%。采用优化处方和工艺制备的注射用重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白制剂质量稳定,符合临床用药要求。结论 优选的注射用重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白制剂处方工艺合理,适合工业化生产。

分子排阻色谱法测定德谷胰岛素高分子蛋白含量

目的建立德谷胰岛素高分子蛋白质的定量分析测定方法。方法采用Insulin HMWP色谱柱(7.8 mm×300 mm,10mm),以冰醋酸-异丙醇-水(4∶3∶10)为流动相,流速为0.5 mL·min^-1,检测波长为280 nm,利用分子排阻色谱法分离德谷胰岛素单体以及高分子蛋白质,并对高分子蛋白质进行定量分析。结果该方法的检测限和定量限分别为0.18和0.47μg;仪器精密度RSD为0.51%,德谷胰岛素在0.125~4.0mg·mL^-1内与峰面积呈良好的线性关系,回归方程为Y=20.864 1X-0.125 9,R^2=1.000 0;德谷胰岛素主峰与高分子蛋白质峰的分离度>2.0。结论建立的方法操作简便,灵敏度高,可有效地对德谷胰岛素高分子蛋白质进行定量分析。

木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶的研究进展

木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶(papain-like cysteine proteases,PLCPs)广泛存在于三界生物中,执行多种生物学功能,是目前研究较多的一类半胱氨酸蛋白酶。这些酶拥有与木瓜蛋白酶相似的折叠方式,包含两个典型的结构域L-domain和R-domain,和一个保守的Cys-His-Asn催化三分体以及与底物结合的活性中心口袋。本文对PLCPs参与的生理和病理过程、分类、激活方式、催化机制等方面进行了阐述,旨在进一步加深对PLCPs的结构和功能的认识。

白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白表达纯化及活性研究

[目的]采用大肠杆菌表达白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白,表达纯化后进行抗细胞黏附活性及抑制凝血酶活性的功能研究。[方法]将编码白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白的基因构建到pET28a载体上,转化菌株Rosetta(DE3)并经IPTG诱导表达后分别经镍柱和分子筛进一步纯化,使用实时细胞分析仪和血凝仪分别测定了白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白的抗粘附活性及抗凝血活性。[结果]成功表达并纯化出白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白,并测定了嵌合蛋白生化及细胞水平活性。[结论]白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白在大肠杆菌中经IPTG诱导表达。经亲和层析和分子筛层析纯化,蛋白纯度达到90%以上,该蛋白同时具有抗细胞粘附及抗凝血双功能,为后续成药性开发奠定基础。

索马鲁肽原料中N-羟基琥珀酰亚胺残留量反相高效液相色谱检测方法的建立及验证

目的建立检测索马鲁肽原料中N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxy succinimide,NHS)残留量的反相高效液相色谱(reverse phase-high performance liquid chromatography,RP-HPLC)法,并进行验证。方法筛选色谱柱并优化流动相条件(磷酸盐浓度与有机相比例),建立检测索马鲁肽原料中NHS残留量的RP-HPLC法,并验证方法的专属性、适用性、准确度、重复性和稳定性,确定线性范围及定量限、检测限。用建立的方法检测3批索马鲁肽中NHS含量。结果确定的色谱条件如下:色谱柱为CAPCELL PAK ADME(4.6 mm×150 mm,3μm);流动相A为0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液-乙腈(98∶2),流动相B为70%乙腈溶液;洗脱梯度为0 min 0%B,10 min 0%B,19 min 90%B,19.1 min 0%B,25 min 0%B;流速为0.8 mL/min;检测波长为260 nm;柱温为30℃。建立的方法在0.2~3.0μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系,R^(2)=1.0000,检测限和定量限分别为4.8和9.6 ng;专属性、系统适用性良好;3种不同浓度NHS加样样品回收率的相对标准偏差(RSD)为0.58%,准确度良好;6份供试品溶液中NHS含量的RSD为0.16%,重复性良好;室温放置0、4、8、12、16、20和24 h NHS峰面积的RSD为0.34%,稳定性良好。3批索马鲁肽中均未检出NHS。结论建立的RP-HPLC法简单、灵敏度高,可用于索马鲁肽原料中NHS含量的测定。

重组大肠杆菌高密度、高表达研究进展

高密度发酵因其节约、高效等诸多优点而成为近年来发酵工业重要的研究热点之一。要实现重组大肠杆菌高密度发酵,不仅要考虑工程菌自身的表达性能,还必须兼顾能促进基因工程菌生长和产物表达的最适培养条件,包括较佳的培养基组成、适宜的补料策略、培养温度、pH值、溶解氧等。该文就影响大肠杆菌高密度发酵的影响因子、工艺条件等进行综述,并探讨了大肠杆菌高密度发酵的工艺改进方向。

分子排阻色谱双检测器串联法测定聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子的聚乙二醇修饰度

目的建立分子排阻色谱紫外与示差折光检测器串联(molecular exclusion chromatography with ultraviolet and refractive index detectors in series,SEC-UV-RI-HPLC)法测定聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)化重组人粒细胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte colony-stimulating factor,rhG-CSF)的修饰度,并对方法进行验证。方法采用TSKgel G3000SWXL(300 mm×7.8 mm)凝胶色谱柱,以0.01 mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠-0.1 mol/L氯化钠(pH 7.0)为流动相,流速:0.5 mL/min,柱温:25℃,示差折光检测器温度:35℃,波长:280 nm,进样量:20μL。通过测定rhG-CSF中间体的UV、RI峰面积,PEG的RI峰面积,PEG-rhG-CSF原液的UV、RI峰面积等,计算出PEG修饰度。对建立的方法进行专属性、线性、精密性、耐用性验证。结果样品在0.2~1.0 mg/mL范围内线性关系良好(R2=0.999);精密性和耐用性试验相对标准偏差分别为1.54%和1.77%;专属性良好。结论建立的方法具有良好的专属性、线性、精密性及耐用性,操作简单,可用于测定PEG-rhG-CSF的修饰度。

浅谈高效液相色谱法测定地特胰岛素含量

目的建立测定地特胰岛素含量的高效液相色谱法。方法色谱柱为Proteonavi C4 (5um 4.6*250mm);流动相A为0.2mol/L硫酸钠溶液(pH2.5)-乙腈(9:1,V/V),流动相B为70%乙腈,梯度洗脱; 流速为1.0mL/min,检测波长为214nm,柱温为40℃,进样量为20μL。结果地特胰岛素浓度在0.125mg/ml~2.0mg/ml范围内与峰面积线性关系良好,定量限为5μg/ml,重复性、中间精密度、稳定性试验的RSD分别为0.2%、1.01%、0.39%,各浓度下的加样回收率分别为99%、99%、98%。结论该方法精密度、稳定性、重复性好,专属性强,准确度高,且具有良好的线性关系,适用于地特胰岛素的含量测定。