高热稳定性己糖激酶在大肠杆菌中的表征和表达优化

己糖激酶是血糖检测中的重要诊断试剂,因此对其酶活和热稳定性要求较高。目前国内己糖激酶主要依赖进口,大多是酵母来源酶,其价格昂贵且存在热稳定性较差等问题,限制了国内血糖诊断试剂的开发。因此,当前亟待实现高活性、高热稳定性己糖激酶的高效表达。本研究在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中异源表达了一种来源于嗜热菌的ATP依赖型己糖激酶(glucokinase,Glk),发现其对葡萄糖特异性高、依赖Mg2+,最适pH和温度分别为8.5和80℃,在30-37℃下保存7 d后酶活保留90%以上,属于热稳定的偏碱性葡萄糖激酶。随后系统优化了Glk表达的培养基、诱导时机、诱导剂终浓度、诱导温度、诱导时长等因素,优化后Glk表达量相比于优化前提高了4.71倍。Glk纯化后,比酶活达到(43.05±2.00)U/mg,纯度达到95%以上。本研究开发的高热稳定己糖激酶的表达和纯化方法,为突破血糖诊断试剂制备中的短板提供了更多可能性和发展空间。