PRRSV NJ-a株ORF5基因A表位的修饰与糖基化位点的突变对其DNA疫苗免疫效力的影响

为了提高PRRSVORF5基因的免疫效力,对ORF5基因进行了改造,将CpG序列和通用型辅助性T淋巴细胞表位插入A表位与B表位之间,并对N33与N51位糖基化位点进行了点突变,获得改造的ORF5基因。在此基础上构建了由两个CMV启动子调控的共表达改造的ORF5(MORF5)与ORF6基因的真核表达质粒pcDNA-M5A-6A。经Western-blot与IFA验证真核质粒的体外表达后,免疫6周龄Balb/c小鼠,利用微量中和试验检测免疫后的中和抗体,利用MTT法检测免疫后淋巴细胞的增生情况,并与未改造ORF5基因真核表达质粒pcDNA-5A-6A、弱毒疫苗以及灭活疫苗的免疫效果进行比较。结果表明,pcDNA-M5A-6A不但能够刺激免疫小鼠在较短的时间内产生更高水平的中和抗体,而且可以诱导产生更强烈的T淋巴细胞增殖反应。所构建的共表达PRRSV改造的ORF5基因与ORF6基因的DNA疫苗pcDNA-M5A-6A,能够较好的诱发小鼠产生较高的特异性针对PRRSV的中和抗体和细胞免疫应答,为研究能够更好地防制PRRSV的新型疫苗提供了新的思路。

共表达猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒NJ-a株ORF4、ORF5与ORF6基因重组改良型痘苗病毒安卡拉株的构建

为探讨共表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinerep roductive and respiratory syndrome Virus,PRRSV)保护性抗原基因的重组改良型痘苗病毒安卡拉株(Modified Vaccinia Virus Ankala,MVA)的免疫效力,将PRRSVNJ-a株ORF4、ORF5和ORF6基因插入转移载体pⅡLR中,获得了三基因共表达的转移载体pⅡLR-ORF5/ORF6/ORF4,通过同源重组的方法获得重组病毒rMVA-GP5/M/GP4。以lacZ为报告基因进行噬斑筛选和重组病毒纯化后,PCR方法证明ORF4、ORF5和ORF6成功的插入MVA基因组中;经Western blot检测与间接免疫荧光试验证实,重组病毒感染细胞能正确表达PRRSVGP4、GP5与M蛋白。用rMVA-GP5/M/GP4免疫6周龄Babl/C小鼠,首免后3周可检测到特异性PRRSV中和抗体,8周后中和抗体效价可达25,并能继续维持4周;淋巴细胞增殖试验结果表明,重组病毒免疫小鼠产生强烈的特异性细胞增殖反应。上述研究结果表明rMVA-GP5/M/GP4具有良好的免疫原性,可作为预防PRRS的候选疫苗进一步研究。

猪繁殖与呼吸综合征病毒NJ-a株ORF6基因的表达及特异性抗体的制备

根据GenBank公布的猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)VR2332株的核酸序列设计并合成1对特异性引物,用RT-PCR方法扩增PRRSV NJ-a株ORF6基因,将其连接入pMD18-T载体,经测序后克隆入原核表达载体pET-32a(+)上,构建原核表达载体pET-ORF6。阳性质粒转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),经异醛-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,PRRSVORF6基因获得表达。以纯化的重组蛋白为抗原免疫家兔3次,获得抗PRRSV NJ-a株M蛋白的特异抗体。经Western-blotting证明,该多克隆抗体既能与原核表达的重组M蛋白发生反应,又能与PRRSV发生特异性反应;间接免疫荧光结果表明,获得的多克隆抗体与表达PRRSV M蛋白的293T细胞及感染PRRSV的Marc-145细胞发生反应。兔抗PRRSV NJ-a株M蛋白特异性抗体的获得,为进一步研究PRRSV M蛋白的表达和功能奠定了基础。

禽流感病毒H5N1亚型HA基因表达及其产物的应用

根据GenBank公布的禽流感病毒H5N1亚型血凝素基因(HA)(GenBank:DQ023145)序列设计一对引物P1、P2,以重组质粒pUC-HA为模板扩增去除信号肽的HA成熟蛋白。PCR产物克隆入pMD18-T载体,经测序发现在967位A突变为T,形成一个终止密码子TAA。在突变位点附近设计两条有21个碱基配对的突变引物P3、P4,采用重叠延伸剪切法(SOE)用A定点替换T碱基,然后将正确的基因片段定向插入到表达载体pET-32a(+)中,诱导表达获得正确的表达产物。Western-blot分析表明,表达的重组蛋白能与经BL21(DE3)大肠杆菌菌体裂解液处理的H5亚型禽流感病毒阳性抗血清发生特异性反应。利用纯化的重组HA蛋白初步建立了检测H5亚型禽流感病毒抗体的间接ELISA方法,该方法可以代替传统的血凝与血凝抑制方法用于区分禽流感病毒的血清亚型。本研究为禽流感病毒亚单位疫苗及新型诊断试剂盒的研究奠定了基础。

硫代甜菜碱对小鼠的急性和亚急性毒性试验研究

为提供硫代甜菜碱的安全性评价资料,进行了硫代甜菜碱对小鼠的急性毒性和亚急性毒性试验研究。采用改良Karber法测得硫代甜菜碱对小鼠的口服急性毒性LD50为(每千克体重)3739.4mg,LD50的95%可信限为(每千克体重)3449.1～4054.2mg,属低毒;采用经口灌胃法对小鼠连续给药30d,30d后对各项指标的测定结果表明,硫代甜菜碱在使用剂量范围内对小鼠的行为、体重、饮食状况、生理和生化指标均无不良影响。由此可知:硫代甜菜碱毒性极低,在临床使用剂量下,作为饲料添加剂长期使用不会引起毒性反应。

高职动物医疗类专业行动导向教材体系的研究

随着畜牧兽医行业的发展变化，高职动物医疗类专业毕业生就业岗位类型、临床诊疗方式、动物种类、疾病种类和主要处理方式也有了一定的变化。因此必须构建理论与实践相融合，以畜种病课程体系代替原有临床课的课程体系。由专业基本能力素质课程、专业核心能力课程、专业综合能力课程和职业拓展课程组成的新课程教材体系，才能满足现代企业对动物医学高职人才的需要。

硫代甜菜碱对小鼠的急性和亚急性毒性试验

为硫代甜菜碱的安全性评价提供资料,试验进行硫代甜菜碱对小鼠的急性毒性和亚急性毒性研究。采用改良寇氏法测得硫代甜菜碱对小鼠的口服急性毒性LD50为3739.4mg/kg体质量,LD50的95%可信限为3449.1～4054.2mg/kg体质量,属低毒;采用经口灌胃法对小鼠连续给药1个月,30d后各项指标的测定结果表明,硫代甜菜碱在使用剂量范围内对小鼠的行为、体质量、饮食状况及生理生化指标均无不良影响。硫代甜菜碱毒性极低,在临床使用剂量下,作为饲料添加剂长期使用不会引起毒性反应。

一例犬急性肾损伤的诊断及治疗

急性肾损伤是一种由于局部缺血、缺氧或毒素等原因导致肾小球滤过率突然下降,从而引发以氮质血症和酸碱紊乱为特征的综合症。一般情况下,犬类在患上急性肾损伤之后,发病的速度会非常快,并且过程短,如果不第一时间采取措施进行治疗,或者治疗时出现差错,极有可能对犬的生命造成严重地影响。本文介绍了一例犬急性肾损伤病例的诊治过程,供同行参考。

BMPR-IB、BMP15、ESR、GDF9与ADAMTS1基因多态性与杜泊羊繁殖性状的关联性分析

为揭示绵羊繁殖力的影响机制,利用分子标记辅助选择来快速提高绵羊的繁殖性能,本实验采用直接测序法对杜泊羊与湖羊群体5个基因中的突变位点进行了比较分析。结合测序后序列通过DNAStar软件预测蛋白质二级结构;统计基因型频率、基因频率、纯合度、杂合度和多态信息含量并将基因多态性与产羔数进行关联分析。结果表明:杜泊羊ESR2基因中的RS428438934位点处发生T→C突变,导致氨基酸发生了改变,CC与CT、TT与CT基因型之间产羔数差异显著;RS418841713在杜泊羊与湖羊中都具有多态性,处于不平衡状态;RS398521635、RS402413016、G7、G8、RS417060437、RS604746425在杜泊羊与湖羊中均只有1种基因型,无突变类型,处于Hardy-Weinberg平衡状态。

猪睾丸支持细胞培养液对精子活力的影响

近年来猪的繁殖方式主要采用人工授精,人工授精的成功率决定因素之一是精子的活力,为了提高猪的精子活力,尝试采用体外添加猪睾丸支持细胞培养液的方法,观察猪睾丸支持细胞培养液对猪精子活力的作用,分析猪睾丸支持细胞分泌物浓度对精子活力的影响,提出提升猪体外人工授精效率的新方式。以猪精子为研究对象,采用计算机辅助精子质量分析系统,检测体外添加猪睾丸支持细胞培养液后精子活力的变化。结果显示,人工授精时,试管中猪精液的精子数量大约为8×10^(8)个时,体外添加2 mL猪睾丸支持细胞培养液,其精子活力由44.3%±1.06%提高至50.9%±2.44%(P<0.01),输精效果最好;体外分离培养猪睾丸支持细胞1 h后收集的培养液对精子活力的影响显著高于对照组(P<0.01)。说明猪睾丸支持细胞培养液可显著提高猪的精子活力,进而提高猪的生产力,提升猪人工授精的效率,进而改善经济效益。

颗粒细胞双阶段共培养模式对性成熟前绵羊卵母细胞体外成熟的影响

为改善性成熟前绵羊卵母细胞的体外成熟质量和发育能力,本研究通过构建颗粒细胞双阶段共培养模式来优化性成熟前绵羊卵母细胞体外成熟(IVM)体系,为利用颗粒细胞-卵母细胞双阶段共培养模式来改善卵母细胞体外发育能力提供依据。本实验以常规方法IVM 24 h作为对照,双阶段共培养组在以颗粒细胞为滋养层与卵母细胞共培养6 h后,继续用常规成熟培养基IVM至27 h。统计所有处理组IVM后的卵母细胞进行核成熟率、卵母细胞老化、线粒体分布情况和活性氧(ROS)水平。结果表明:颗粒细胞双阶段共培养组的卵母细胞核成熟率(58.15%)略高于对照组(P>0.05);线粒体呈皮质/核周分布的比例(56.25%)高于对照组(P<0.05);而卵母细胞的老化率(17.40%)、胞质内ROS水平(9.78%)均低于IVM 27 h组卵母细胞(P<0.05),与对照组无显著差异。综上所述,颗粒细胞双阶段共培养模式可以解除颗粒细胞对减速分裂的抑制作用,促进线粒体正确分布,抑制胞质内ROS水平升高,减缓因延长IVM时间造成的卵母细胞老化情况。

鸡住白细胞原虫病的诊断与防治

鸡住白细胞虫病是一种血液原虫病。在我国各地均有发生。常呈地方性流行，特别是2000年至今在全国部分地区如潍坊、烟台、青岛呈流行趋势。据不完全统计，在昌邑及周边市，如平度、高密、安丘的周边乡10％以上鸡场发生过该病，肉用仔鸡危害严重，发病率高，症状明显，常引起大批死亡，给养鸡场（户）造成很大经济损失。

猪传染性胸膜肺炎发病原因及防治措施探讨

猪传染性胸膜肺炎从理论上来说是一种常见的接触性传染病,猪患上这种病的可能性比较大,因为它们的呼吸道容易受到猪胸膜肺炎放线杆菌的损害。许多养猪的国家常常受到这种病的侵扰从而对社会经济造成负面影响,所以相关专家力求找到有效合理的治疗方法来改变现状。抗生素常常被用在感染病的治疗中,然而在治疗猪传染性胸膜肺炎时使用抗生素没有太大作用。本文对猪传染性胸膜肺炎的发病原因进行分析,通过这种感染病的发病机制探索有效的防治措施。

夏季猪热应激及其防控措施

应激这一概念最早是由加拿大病理学家Hansseyle博士提出，他认为应激就像是生病一样，温度、饲料成分、饲养制度的改变、神经刺激和有害气体等许多完全不同的致病因子在机体特异反应中均有相同或相似的非特异反应。随着研究的不断深入，人们把应激定义为机体对外界或内部的各种异常刺激而产生的非特异性应答反应的总和。

金毛猎犬呼吸性碱中毒的诊断

呼吸性碱中毒指的是血液中二氧化碳的浓度降低，特征就是降低的PCO2B及增加的pH值，呼吸性碱中毒发生在每当肺泡换气强度大于组织代谢所产生需要排除的二氧化碳量的时候。

波尔山羊冷冻精液稀释液及稀释倍数的研究

一头纯种波尔山羊公羊,本交可以解决50头母羊的配种。若采用冷冻精液授精,如低倍稀释,一年内至少可以配种母羊500头以上;如高倍稀释,一头公羊则可以配10000只以上,可见人工授精的优势。要想加快我国地方品种的改良步伐并保证优质优效,应大力推广波尔山羊的统一供精,目前需要解决波尔山羊冷冻精液制作技术的问题。为此对波尔山羊精液的冷冻保存效果进行了研究,主要包括稀释液配方的筛选、不同稀释倍数的效果研究及细管冻精的制作。结果表明Ⅳ号配方效果显著,稀释倍数适宜在4～6倍,进一步完善后可进行推广使用。

一例德牧犬呼吸性碱中毒病例诊疗体会

呼吸性碱中毒指的是血液中CO2的浓度降低，特征就是降低的二氧化碳分压（PCO2）及增加的pH值。呼吸l生碱中毒发生在每当肺泡换气强度大于组织代谢所产生需要排除的CO2量的时候。笔者就一例典型呼吸性碱中毒病例诊治情况介绍如下。