菊花AINTEGUMENTA克隆与功能分析

【目的】从菊花中分离克隆AINTEGUMENTA,分析其序列特征和在菊花中的时空表达特性,通过基因沉默研究其对菊花花序发育的影响,分析可能的调控方式和潜在机理,为菊花花序大小的调控奠定理论基础。【方法】使用RACE方法从菊花中克隆AINTEGUMENTA全长,通过DNAMAN等软件对其序列进行分析。采用荧光定量的方式检测其在菊花不同器官和发育时期的表达。构建35S::CmANT-GFP融合蛋白载体进行亚细胞定位,构建TRV2-CmANT沉默表达载体侵染菊花。使用SPSS软件统计分析CmANT沉默系菊花表型变化,通过光学显微镜观察舌状花花瓣表皮细胞变化,使用荧光定量方式检测CmANT相关基因在沉默系中的表达。【结果】从菊花中克隆了CmANT全长,其编码的氨基酸序列长度为540,理论等电点为7.39,蛋白质的理论分子量为60.4 k D,含有两个AP2保守功能区域和VYL修饰位点。在与其他物种的ANT蛋白构建的系统进化树中,CmANT与At ANT聚在一起。荧光定量结果表明:(1)CmANT在花蕾中的表达量最高,其次是根>茎>叶。(2)在花序不同部位的比较中,舌状花中的表达量最高,其次是筒状花,在花萼中的表达量最低。(3)CmANT在舌状花中的表达随着发育时期的延续而降低。(4)CmANT在2,4-D诱导下的3—6 h内表达量持续上升。Wo LF PSORT软件预测和35S::CmANT-GFP融合蛋白在洋葱表皮细胞中的定位结果显示,CmANT蛋白定位在植物细胞核中。TRV-CmANT-1和TRV-CmANT-2沉默系的平均花径相比对照分别减小18.93%和27.47%,舌状花的数目分别减少11.39%和14.66%,其中TRV-CmANT-2与对照差异显著(P<0.05),筒状花数目分别减少14.55%和36.56%。顶端花序的舌状花平均长度分别减少34.17%和54.68%,舌状花的宽度分别比对照减小24.05%和10.13%。叶片平均鲜重分别比对照组减小13.19%和21.98%,叶片鲜重与筒状花数目显著相关(P<0.05)。舌状花花瓣表皮细胞显微观察发现,沉默系舌状花花瓣表皮细胞长度和宽度与对照差异不明显。CmLAX3在两沉默系中的表达明显上升,在小花原基分化期时分别是对照中的1.8和1.78倍,同期CmCYCD3的表达分别下降了32.28%和38.19%,CmXTH4和CmEXPA1的表达量在多个时期也明显降低。【结论】根据沉默系表型与相关基因的表达,推测CmANT的沉默可能解除了对CmLAX3抑制,促进了生长素的转运和过量积累,间接抑制了CmCYCD3的活性,限制了细胞的分裂增殖,引发细胞数目变少,导致沉默系器官变小。

硝态氮影响菊花根系形态结构变化的分子基础

【目的】通过观察硝态氮处理下菊花根系外观形态和解剖结构、根系和叶片中硝态氮含量、内源激素水平以及根系硝态氮转运蛋白基因和侧根发育特异基因表达量的变化,揭示硝态氮对菊花根系发育的影响及其分子基础,为氮素高效利用的菊花分子育种提供依据。【方法】利用菊花扦插生根苗的水培试验,用10 mmol·L^(-1) KNO_3处理(对照为不含N元素的Hogland营养液)后,分别在第0、1、3、7、14、21和28天观察菊花根系外观形态和解剖结构,测定根系和叶片硝态氮(NO3-)、吲哚-3-乙酸(IAA)和细胞分裂素(CTK)含量,克隆菊花根系硝态氮转运蛋白基因CmNRT1.1、CmNRT2.1、CmNAR2.1和侧根发育特异转录因子基因CmANR1的c DNA保守序列片段,并用实时荧光定量PCR技术检测它们在根系中的相对表达量。【结果】与对照相比,处理的根系总根长、平均直径、总表面积、总体积和根尖数至处理第3天均没有显著差异,但第7天时均显著增加,且随着处理时间的延长,增加的幅度增大。显微观察第28天时的根横切面表明,与对照相比,1级根、2级根和3级根的维管束直径和维管束占根横切面的比值均出现了不同程度的增加。处理的根系和叶片的NO_3^-含量分别在处理第7天和第14天时达到高峰(峰值分别为0.45和0.35 mg·g^(-1) FW),之后虽有所回落,但与对照相比始终处于较高水平(对照的根系和叶片硝态氮含量分别保持在0.17—0.27 mg·g^(-1) FW和0.16—0.22 mg·g^(-1) FW)。处理的根系、叶片的IAA和CTK含量与对照相比均显著增加,根系IAA和CTK含量高峰在第7天出现,叶片的在第14天出现,而对照的IAA和CTK含量无明显变化。处理的根系硝态氮信号感应和低亲和型转运蛋白基因CmNRT1.1的相对表达量高峰出现在第1天(对照也为第1天);高亲和型硝态氮转运蛋白基因CmNRT2.1和二者的互作蛋白基因CmNAR2.1的相对表达量高峰均出现在第3天(对照在第3天稍微增加后保持相对稳定);菊花侧根发育基因CmANR1的相对表达量在第7天达到高峰(对照为第14天)。硝态氮处理后这4个基因的相对表达量与对照相比始终处于较高水平,表达趋势也相似,都是先升高后降低再保持相对稳定,表明它们均受硝态氮信号诱导。【结论】菊花根系能通过硝态氮转运蛋白基因和侧根发育基因的表达来响应生长介质中的硝态氮信号,进而调控根系构型的改变,来提高菊花根系对硝态氮的吸收和利用。

菊花基因组DNA甲基化水平对根系硝态氮吸收的影响

以菊花的扦插生根苗为试材,在缺氮和适氮水培条件下,分别使用甲基化抑制剂(5-aza C)和甲基供体(SAM)处理菊花根系,测定处理后基因组DNA甲基化水平变化、根系构型相关参数、根系硝态氮含量以及NO3-转运蛋白基因Cm NRT1.1、Cm NRT2.1、Cm NAR2.1的相对表达量。结果表明,在适氮条件下,5-aza C处理的菊花根系DNA甲基化水平降低,根系总直径、总表面积及总体积增大;根系NO3-含量与对照相比显著增加,根系NO3-转运蛋白基因Cm NRT1.1、Cm NRT2.1、Cm NAR2.1相对表达量也有所升高。据此推测,降低菊花根系基因组DNA甲基化水平可以提高根系NO3-转运相关基因的表达,进而促进根系对NO3-的吸收。

菊花花瓣伸长相关基因CmXTHs的克隆与功能验证

从杭白菊(Chrysanthemum morifolium‘Hangbaiju’)中克隆了4个细胞壁松弛和伸展相关的木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因,分别命名为CmXTH1、CmXTH2、CmXTH3和CmXTH4,序列分析表明其编码的氨基酸序列N端都含有23~30个氨基酸组成的信号肽区域和保守的催化活性位点DE(I/L)DEFLG以及紧邻的N(R/A)T组成的N端糖基化位点,CmXTH1/2/3的C端均含有4个保守的半胱氨酸残基,CmXTH1/2/3/4蛋白的相似度为66.2%。系统进化分析结果表明,CmXTH1/2/3属于XTH家族Ⅰ组,CmXTH4属于Ⅱ组。实时荧光定量结果表明:(1)菊花CmXTH1/2/3/4在根、茎、叶和花蕾中均有表达。CmXTH1在根中表达量较高,CmXTH2/3在茎中表达量较高,CmXTH4在花蕾中表达量最高。(2)CmXTH1/2/3/4在花序不同部位表达量有差异,CmXTH1/4在舌状花中表达量最高,CmXTH2/3在筒状花中表达量较高。(3)CmXTH1/2/3/4在舌状花不同发育阶段表达量差异显著,CmXTH1/2在盛花期表达量最高,CmXTH3在衰老期表达量最高,CmXTH4在初开期表达量最高。病毒诱导基因沉默结果表明,CmXTH1/2/3/4沉默系的花序直径和舌状花长度与对照相比均有所减小,其中CmXTH4沉默系减小最大,分别减小了25.67%和10.42%,舌状花花瓣表皮细胞与对照相比明显变小,影响了舌状花花瓣的伸长;CmXTH2沉默系的筒状花雄蕊长度和CmXTH4沉默系的花萼直径分别与对照相比显著减小。这表明菊花CmXTH1/2/3/4基因参与了花序的开放,促进了舌状花花瓣的伸长,对于菊花的花序增大具有重要作用。

生物炭与氮肥配施对牡丹叶片氮素营养和籽粒品质的影响

利用田间小区试验,设计生物炭用量为0(B_0)、1 kg·m^(-2)2(B_1)、2 kg·m^(-2)2(B_2)3个水平,氮肥用量为0(N_0)、40 g·m^(-2)2(N_1)、60 g·m^(-2)2(N_2)3个水平,即B_0N_0、B_0N_1、B_0N_2、B_1N_0、B_1N_1、B_1N_2、B_2N_0、B_2N_1和B_2N_2共9个处理,研究了生物炭与氮肥配施对牡丹叶片的氮素积累、叶片氮素向籽粒转移、籽粒蛋白氮、氨基酸和脂肪酸含量,以及籽粒产量和品质的影响.结果表明:生物炭与氮肥配施增加了牡丹不同发育时期叶片中蛋白氮和非蛋白氮含量,以及叶片氮素向籽粒的转移量和籽粒氮素积累量.与B_0N_0处理相比,B_1N_1处理叶片氮素转移量和籽粒氮素积累量分别增加27.6%和27.1%;B_1N_1和B_2N_1处理牡丹籽粒百粒重和籽粒产量分别增加13.6%和16.4%,其中籽粒产量在B_1N_1、B_1N_2、B_2N_1和B_2N_2处理间差异不显著;B_2N_1和B_1N_2处理牡丹籽粒蛋白氮和总氨基酸含量较高,分别增加29.3%和36.2%.生物炭与氮肥配施增加了牡丹籽粒中总脂肪酸和不饱和脂肪酸的含量,其中,B_2N_1处理总脂肪酸含量较高,比B_0N_0处理增加了17.4%.生物炭与氮肥配施能够增加牡丹叶片氮素积累量和叶片氮素向籽粒的转移量,增加籽粒产量,提高牡丹籽粒蛋白氮、氨基酸和脂肪酸的含量,其中以生物炭1 kg·m^(-2)2与氮肥40 g·m^(-2)2配施效果较好.

施用氮肥对油用牡丹叶片氮素吸收积累与籽粒品质的影响

利用田间栽培试验,研究0(对照)、18、24和30 g N·m^(-2)4个氮肥用量对油用牡丹"凤丹"叶片氮素吸收转运以及籽粒产量和品质的影响.结果表明:施用氮肥处理牡丹株高、冠幅、花径和花干质量与对照相比均显著增加,其中,24和30 g·m^(-2)氮肥处理株高比对照分别增加14.7%和15.2%.施用氮肥提高了牡丹籽粒的相关指标,24和30 g·m^(-2)氮肥处理籽粒产量达到最大,分别比对照增加15.2%和15.4%.施用氮肥明显增加了叶片氮素积累量、叶片氮素转移量和籽粒氮素积累量.其中,24 g·m^(-2)氮肥处理叶片氮素对籽粒贡献率最大.与对照相比,施用氮肥明显提高了籽粒蛋白氮、总氨基酸,以及部分饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的含量.在本试验条件下,施氮量为24 g N·m^(-2)时,叶片积累氮素向籽粒的转移量、转移率和贡献率均达到较高水平,籽粒产量较高,并且蛋白氮、氨基酸含量和不饱和脂肪酸含量也相对较高.