山东省铁皮石斛引种、产业现状与可持续发展的探讨

山东省具有典型的北方气候,铁皮石斛在山东省引种、栽培的成功,对于选育出适合北方气候铁皮石斛新品种具有重要的现实意义。本文针对山东省铁皮石斛的引种、栽培、产业发展现状进行综述,并根据这些现状和存在问题提出山东省铁皮石斛可持续发展的建议,以促进北方铁皮石斛产业的健康发展。

应用多重实时荧光PCR方法对8种动物毛纤维种类鉴别的研究

本研究旨在利用多重实时荧光PCR方法对水貂、狐狸、骆驼、兔、山羊、绵羊、鸭和鹅8种动物毛纤维进行物种鉴定研究。利用碱裂解法加入二硫苏糖醇,并结合硅珠吸附核酸法来优化动物毛纤维DNA的提取;根据8种动物16S rDNA基因特异核苷酸序列设计通用PCR引物和特异性TaqMan荧光探针;通过优化引物和探针浓度及退火温度等PCR反应体系和条件,建立了多重实时荧光PCR检测体系;并对多重PCR体系的特异性、灵敏度、重复性和适用性进行评估。结果表明,使用SDS-二硫苏糖醇DTT-蛋白酶K结合Chelex-100法,并利用硅珠纯化提取动物毛纤维DNA效果最佳,满足实时荧光PCR检测要求。本方法 DNA灵敏度为0.01ng,混合样本方法检出限为1.0%。因此本方法能够从动物毛纤维提取高质量DNA,建立的多重实时荧光PCR检测体系具有特异性强、重复性好和灵敏度高等优势。本方法可用于水貂、狐狸、骆驼、兔、山羊、绵羊、鸭和鹅8种动物及其混合物毛纤维的鉴定,为拓展动物毛纤维在物种识别、分子进化研究、分子标记辅助育种和遗传资源评价等领域中的应用奠定基础。

DNA条形码与实时荧光定量PCR技术在铁皮石斛鉴定中的应用

为建立铁皮石斛准确、高效的鉴定体系,本研究以101份石斛属和蝴蝶兰属植物样品为试验材料,通过对比ITS、psbA-trnH、matK及rbcL基因在石斛属植物中的鉴定能力,筛选出ITS作为本研究最理想的DNA条形码。以ITS序列作为靶基因,设计铁皮石斛特异引物和特异探针,以及石斛属通用引物和探针,利用实时荧光定量PCR(TaqMan)技术,建立铁皮石斛多重实时荧光PCR检测新体系,通过特异性、灵敏度和实际样本验证,发现参试样品中的25份铁皮石斛均可被有效鉴定,与其他鉴定方法相比,该方法具有特异性强、灵敏度高(高出普通PCR 100倍)、重复性好且高效经济的优势。本研究结果对铁皮石斛的资源保护与利用起到了积极作用。

一种从阿胶及制品中提取DNA的新方法

目的建立一种从阿胶及制品中提取微量DNA的方法,为从分子水平鉴别阿胶中动物源性奠定基础。方法选取市场常见的阿胶补血口服液、复方阿胶浆、阿胶膏和即食阿胶块等4种不同的阿胶制品,使用SDS-蛋白酶K结合Chelex-100法提取DNA,利用玻璃奶纯化DNA。结果此法可从不同阿胶产品中提取微量DNA,其中阿胶膏中获得DNA浓度最高,即食阿胶块次之,复方阿胶浆和阿胶补血口服液中最少。PCR扩增获得片段利用琼脂糖凝胶电泳和DNA测序验证与目的片段一致。结论建立了从阿胶及其制品中提取高质量DNA的新方法。

阿胶加工工艺过程中DNA降解规律研究

目的本文以阿胶传统工艺加工过程样品为研究对象,探讨关键加工阶段阿胶样品中驴基因组DNA核基因和线粒体基因的降解变化规律。方法提取阿胶工艺过程中的驴基因组DNA,分别利用超微量分光光度计、琼脂糖凝胶电泳、普通PCR、荧光定量PCR和简单序列重复（SSR）微卫星毛细管电泳（CE）检测方法对提取的DNA质量进行评价。结果研究结果显示,在原料驴皮、化皮、双效、浓缩和加辅料阶段,琼脂糖凝胶电泳均能检测到清晰的条带,普通PCR可扩增到200~1 600 bp左右的片段,而在凝胶阶段DNA降解最为严重,只能利用琼脂糖凝胶电泳检测到100~800 bp的目的片段,利用荧光定量PCR检测技术线粒体基因在阿胶加工各个阶段均可检测出,核基因凝胶阶段未检出;通过PCR-SSR-CE检测在凝胶阶段核基因未检出特征峰,更进一步证明了凝胶阶段DNA核基因降解严重。结论对阿胶工艺加工过程DNA变化规律发现,随着阿胶加工的深入进行,各个阶段DNA发生不同程度的降解,其中凝胶成品阶段降解最为严重,本研究对比普通PCR、荧光定量PCR和简单序列重复微卫星毛细管电泳检测方法,发现荧光定量PCR检测方法最快速、灵敏和可靠,通过比较发现以线粒体基因为靶基因在阿胶的各个加工阶段均能满足DNA溯源的要求。

化妆品中动物源性成分多重实时荧光PCR检测方法的研究

使用优化的Chelex-100结合玻璃奶法提取膏状、液态和固态化妆品中的动物源性DNA;根据驴、马和牛线粒体16S rRNA基因序列设计通用引物和特异性探针,建立了一次性检测化妆品中驴、马和牛3种动物源性成分的多重实时荧光PCR体系,检出限均为0.001 ng。并对市售的面霜、洗面奶和面膜进行盲样检测,验证了体系的可靠性和准确性。

乌头驴和三粉驴微卫星遗传多态性分析

实验旨在了解德州驴中乌头驴和三粉驴2个品系的遗传多态性。利用13个微卫星位点,通过建立多重多色毛细管电泳荧光检测方法,对39头三粉驴和16头乌头驴进行遗传多样性分析,对等位基因数、多态信息含量(PIC)、遗传杂合度和有效等位基因数进行统计分析。结果表明:13对微卫星位点三粉驴PIC指数平均值为0.47,乌头驴PIC指数平均值为0.40,德州驴2个品系PIC总的平均值为0.47。其中乌头驴品系平均等位基因数为3.31,平均观测杂合度为0.27,有效等位基因数为2.11。三粉驴品系平均等位基因数为4.46,平均观测杂合度为0.33,有效等位基因数为2.61。由此可见,三粉驴比乌头驴的遗传多态性高,但2个驴品系的遗传杂合度均偏低,遗传变异程度较小。

多重实时荧光PCR鉴别金钱白花蛇源性方法研究

目的用多重实时荧光聚合酶链式反应(多重实时荧光PCR)快速鉴别金钱白花蛇源性。方法以线粒体细胞色素C基因为目标靶基因,根据其特异性核酸序列设计引物和探针,通过优化引物及探针浓度、退火温度等PCR体系和条件,建立从活体材料和粉末制剂等中药材中检测金钱白花蛇源性的二重二色实时荧光PCR检测体系。结果通过检测市售15块金钱白花蛇药材,发现其中5块不含金钱白花蛇源性成分;10份金钱白花蛇粉末制剂中3份未检出金钱白花蛇成分;5份活体样本均为金钱白花蛇。检测结果与DNA测序结果一致。结论本研究建立的方法可用于金钱白花蛇源性的检测,能有效保障金钱白花蛇相关名贵中药及制品的安全性。

LAMP法检测牛奶中金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门菌和大肠杆菌O517:H

目的建立一种能快速准确检测牛奶中金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)和大肠杆菌O517:H7(Escherichia coli O517:H7)的环介导恒温扩增方法(loop mediated isothermal amplification,LAMP)。方法以牛奶为研究对象,分别利用金黄色葡萄球菌nuc,鼠伤寒沙门菌invA和大肠杆菌O517:H7的rfbE保守基因设计LAMP特异引物,通过优化反应温度、时间等条件,建立检测牛奶中金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门菌和大肠杆菌O517:H7的LAMP反应体系。并验证了本方法的特异性和灵敏度。结果 LAMP法对牛奶中金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门菌和大肠杆菌O517:H7的灵敏度均为1.0×10~2拷贝/μL,比常规PCR灵敏度提高了10倍。金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O517:H7的LAMP反应条件为60℃、30 min,鼠伤寒沙门菌为60℃、60 min。利用SYBR Green I染料在紫外光下可直接观察检测结果,金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门菌和大肠杆菌O517:H7阳性样品均呈绿色;进一步利用荧光定量PCR仪可检测到对应的扩增曲线。通过牛奶样品模拟掺杂实验,验证了方法的实用性和可靠性。结论本研究建立的检测牛奶中金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门菌和大肠杆菌O517:H7的LAMP方法具有特异性强、灵敏度高、操作简便等特点,可用于牛奶中相关致病菌的检测,对预防和控制3种致病菌的传染有重要意义。

柴胡属药用植物多重实时荧光PCR检测方法的建立

目的用实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)方法测定正品柴胡,为柴胡的分子鉴定提供依据。方法从柴胡根茎中提取总DNA,根据ITS2序列,设计合成针对南柴胡和北柴胡的特异性引物和探针以及柴胡的通用引物与探针,通过对荧光聚合酶链式反应反应体系和反应条件的优化筛选,建立了多重实时荧光聚合酶链式反应方法,在同一聚合酶链式反应反应体系中可以同时鉴别南、北柴胡。结果结果表明本试验设计的引物和探针具有很好的物种特异性,且灵敏度高,DNA检出限为0.08 ng。对46份样品检测,其中17份检出北柴胡源性成分,5份为南柴胡,其他样品均检测为伪品柴胡,检测结果与DNA测序结果一致。结论该方法可以有效地鉴别出南、北柴胡源性成分,及伪品柴胡,对于保证柴胡药材的质量及用药安全具有重要意义。

一种从动物源性化妆品中快速提取DNA的方法研究

为了达到从分子水平上检测化妆品动物源性成分的目的,本研究建立了一种从化妆品中提取动物源性基因组DNA的方法。该方法使用Chelex-100结合玻璃奶提取化妆品中的基因组DNA,具有污染小、操作简单、快速、高效等优点。分别利用紫外分光光度计、普通PCR和DNA测序等方法对提取DNA的质量进行检测,结果表明DNA浓度和纯度均能达到后期分子检测要求。说明本方法提取的DNA适用于在分子水平上检测化妆品的动物源性成分。

一种驴和马及狐狸源性成分快速检测方法的研究

实验旨在建立快速检测驴、马和狐狸源性成分的方法。以驴、马和狐狸的线粒体保守序列16S r RNA基因为靶基因,设计通用引物和以不同荧光素标记的特异Taq Man探针,构建与通用引物共用的阳性扩增内标(Internal Amplification Control,IAC)作为PCR监控反应体系。通过优化PCR反应体系和条件,建立能同时检测驴、马和狐狸源性成分的四重实时荧光PCR方法。结果表明:利用驴、马、狐狸、牛、猪、羊、水貂、狗、鸡、鸭、大豆、小麦、玉米等物种检测没有交叉反应,证明该方法特异性高,准确性好。该方法模板DNA检测灵敏度为0.01 ng。本研究建立的驴、马和狐狸源性四重荧光实时PCR检测体系灵敏度高、特异性强,能有效鉴别动物产品中驴、马和狐狸的源性成分,也可用作相关动物皮张真伪的鉴别方法。

利用环介导等温扩增技术快速检测饮用水中的大肠杆菌

本研究以饮用水为研究对象,利用大肠杆菌mal B保守基因设计LAMP特异引物,通过优化反应条件,建立了适用于快速检测饮用水中大肠杆菌的LAMP方法,可在60℃条件下反应60 min完成检测,检测灵敏度达到1.35 CFU/m L。利用SYBR GreenⅠ染料剂可在紫外灯下直接观察检测结果。通过检测掺入已知大肠杆菌的纯净水样品,结果表明,本研究所建立的LAMP方法具有特异性强、灵敏度高、操作简便的特点,可用于饮用水中大肠杆菌致病菌的快速检测,对预防和控制大肠杆菌的传染具有重要意义。