高通量测序技术在农业研究中的应用

随着高通量测序技术的不断发展和测序成本不断降低,高通量测序近几年在现代农业研究领域中得到了充分应用,为新品种选育和品质改良带来了新的科研方法和解决方案,加快了新品种的育种进程。高通量测序技术的主要应用方向包括对农作物和栽培品种进行全基因组从头测序和深度重测序、遗传差异分析、分子标记开发、遗传连锁分析、表观遗传分析和转录组分析等。本文系统阐述了近几年高通量测序技术在农业研究中的应用进展,展示高通量测序在现代农业研究领域的广泛应用前景。

山东花生主产区花生镉含量与土壤交换性钙含量的关系及其健康风险评价

选择山东花生主产区58个田块进行土壤样品和花生样品的随机采集,测定并分析了土壤镉含量、土壤交换性钙含量、花生镉含量及其相互关系,在此基础上进行了健康风险评价。结果表明:土壤样品中镉的含量为0.03～0.18mg·kg-1,平均为0.069mg·kg-1;所有样品均未超过农业部绿色食品产地土壤环境的质量标准;交换性钙的含量平均为4368mg·kg-1;花生样品中镉的含量为0.019～0.46mg·kg-1,平均为0.14mg·kg-1,按照FAO/WHO规定的无公害食品镉含量标准0.1mg·kg-1,有60.3%的花生样品镉超标;全钙的含量平均为0.528mg·g-1,并且随着土壤中交换性钙含量的升高,花生镉含量有降低的趋势,但相关性较低。花生样品中有12个超出%AD(I100),占取样总数的20.7%,即食用镉含量超过0.2mg·kg-1的花生会对人体膳食健康有一定的风险,并且镉含量越高风险性越大。

不同SSR标记检测技术及其在花生栽培种遗传多样性分析中的应用

以85份花生栽培种为材料,分别应用银染法和荧光检测法检测9对SSR引物的扩增产物。比较结果显示,荧光检测法具有灵敏度高、检测结果准确、效率高等优点。聚类分析表明,银染法与荧光检测法分别能够区分74个、82个花生品种,并分别聚成8个、9个类群;荧光检测法的聚类结果虽然反映的品种间遗传多样性较低,但与品种类型、产地及其亲缘关系相关程度更高,表明荧光检测数据更精确、可靠。遗传多样性分析发现,地方品种的遗传多样性指数最高,其次为多粒型育成品种,表明我国地方品种和多粒型育成品种蕴藏了丰富的优异性状,有利于对其挖掘和利用。

作物吸收富集镉研究进展

土壤镉污染已经成为一个重要的环境问题,植物镉的吸收富集已引起全世界学者的关注。回顾和总结了国内外学者对几种作物镉积累的特点,对比分析了它们可食部位镉的富集系数,并提出了植物吸收积累镉的可能的机制及降低植物镉吸收的方法,最后提出了降低植物镉吸收方面存在的问题和对未来的展望,为今后降低植物镉吸收、防治植物镉污染提供重要的理论指导和思路。

RNA干扰技术在农作物害虫防治中的应用

RNA干扰(RNAi)技术作为基因沉默的工具,已被广泛应用于农作物害虫防治研究。准确选择靶基因、将dsRNA或siRNA导入昆虫体内、siRNA在昆虫体内的扩增和扩散是RNAi技术应用于农作物害虫防治的基础。应用RNAi技术能有效地保护农作物抵抗害虫危害,在农作物遗传改良进行精准抗虫方面具有重大的应用前景。

花生二酰基甘油酰基转移酶基因克隆与功能研究

利用RT-PCR方法,从花生品种‘鲁花14’未成熟种子中克隆了二酰基甘油酰基转移酶(Diacylglycerolacyltransferase,DGAT)基因AhDGAT3A和AhDGAT3B的cDNA,序列分析显示,两者在编码区核苷酸序列有96%相似性,氨基酸序列有94%相似,并对其中的AhDGAT3A进一步研究。(1)半定量RT-PCR分析显示,AhDGAT3A在花生根、茎、叶、花和种子中均有表达,且花中表达量最高,茎中表达量非常低;在花生果针入土60d时种子中的表达量较其它发育时期有所提高。(2)利用染色体步移技术克隆了AhDGAT3A5′上游1 588bp调控区,在线软件分析发现该调控区除包括启动子核心元件外,还包含多个调控花粉中表达的顺式元件、光信号调控元件和胁迫相关元件等。(3)在烟草中过量表达AhDGAT3A基因,转基因烟草种子粗脂肪和主要脂肪酸含量较对照均有所下降,推测这一结果可能由转基因共抑制作用导致。

钙对镉污染花生苗期生理特性及镉吸收的影响

采用水培试验,对不同钙处理下镉污染花生幼苗的生理特性和镉吸收情况进行了研究。结果表明,花生幼苗的株高和鲜重均随钙浓度的增加而增加,而且较高浓度的钙提高了镉胁迫下花生幼苗叶绿素的含量,提高了叶片SOD、POD、CAT活性和根系活力,降低了MDA积累,说明一定范围内高浓度的钙可以缓解镉胁迫对花生生理特性的影响。此外,受镉胁迫的花生幼苗中镉的含量为根部>地上部,且随着钙浓度的增加,花生根部和地上部镉的含量均显著降低,说明在钙与镉进入花生体内时具有一定程度的拮抗作用。

抗水稻黑条矮缩病RNA干扰载体的构建及遗传转化

水稻黑条矮缩病是由水稻黑条矮缩病毒引起的水稻病害,该病可导致病株生长迟缓、矮化、抽穗结实困难,严重影响了水稻的生产。在水稻黑条矮缩病毒基因组不同双链RNA序列的基础上,分别设计了5对特异性引物,通过RT-PCR获得了相应片段,结合基因沉默的方法,分别构建RNA干扰载体,并进一步将发夹结构构建入以玉米泛素Ubi为启动子、以bar基因为选择标记的改造后的植物双元表达载体pCA1300-Ubi中,经农杆菌介导对黄淮稻区主栽水稻品种圣稻13进行遗传转化,成功获得了5个含有水稻黑条矮缩病干扰片段的植物双元表达载体,经农杆菌介导获得了部分水稻转化植株。旨在为下一步对水稻黑条矮缩病的研究及抗病水稻新品种的培育提供材料。

花生对土壤镉吸收及镉的亚细胞分布研究

通过土培试验,以鲁花14为材料,采用盆栽方法,设置0.10(CK)、3.24、7.35、8.38、18.80 mg/kg5种土壤镉浓度,研究了鲁花14各器官对土壤镉的富集效应及其镉在各器官亚细胞的分布。结果表明:随着镉浓度的增加,花生根、茎、叶的镉含量也持续增加,不同镉处理间差异显著。土壤镉浓度小于(包含)8.38mg/kg时,镉含量大小顺序为叶>根>茎;土壤镉浓度为18.80 mg/kg时,镉含量大小为根>叶>茎。镉在根、茎、叶中亚细胞组分中的含量及其分布比例在不同镉处理间不同。土壤镉浓度小于(包含)8.38 mg/kg时,镉在根、茎、叶中亚细胞组分的镉含量为细胞壁>细胞器>可溶部分,镉积累在细胞壁是花生忍耐镉的主要机制。但在18.80 mg/kg时,亚细胞组分的镉含量为细胞器>细胞壁>可溶部分,说明在高镉浓度下,花生受到镉的毒害很严重。

水稻黑条矮缩病毒RNA干扰载体的构建及遗传转化

针对水稻黑条矮缩病毒S6、S10两条RNA双链,参考相关文献,设计了2对引物,通过RT-PCR获得了2条干扰片段,将这些干扰片段分别构建到RNA干扰载体中,进一步将整个RNA干扰片段构建入以玉米泛素Ubi为启动子、以生物安全性的bar基因为选择标记的植物双元表达载体pCA1300-Ubi中,经农杆菌介导对黄淮稻区主栽水稻品种圣稻13进行遗传转化,为下一步对水稻黑条矮缩病的研究及抗性品种的培育提供候选材料。

镉胁迫对花生生长和矿质元素吸收的影响

以鲁花14为材料,采用盆栽的方法,设置0.10(CK)、3.24、7.35、8.38、18.80mg·kg-15种土壤镉浓度,研究了土壤镉胁迫对鲁花14生长和籽粒矿质元素吸收的影响。结果表明:随着镉浓度的增加,花生叶和茎的干重,荚果和籽粒重均呈现先增加后降低的趋势,这几个指标值均在镉浓度为3.24mg·kg-1时达到峰值,而镉浓度达到18.80mg·kg-1时显著低于对照。花生叶、茎、根和籽粒中的镉含量和镉积累量随镉浓度的增加呈持续上升的趋势,且不同土壤镉浓度间差异极显著。镉胁迫对花生籽粒矿质元素含量的影响不一致,随着镉浓度的增加,P元素呈不断下降的趋势,而K、Mg、Ca、Fe、Zn元素呈现先增加后降低的趋势。

Ca^(2+)在植物盐胁迫响应机制中的调控作用

对植物而言,Ca2+不仅作为一种必须的营养元素,更重要的是作为耦联胞外信号与胞内生理反应的第二信使.当植物受到外界的环境刺激时,细胞中Ca2+会出现变化,引起一系列保护性生理反应,从而减轻环境胁迫对植物体的伤害.我国盐碱地面积广阔,极大地限制了作物种植和农业生产.大量研究表明,Ca2+可以提高植物对盐胁迫的抗性,针对盐胁迫对植物的伤害机制,重点讨论了盐胁迫条件下Ca2+参与的植物体内有关响应途径及作用机制.

转小萝卜γ-硫堇蛋白基因RsAFP1水稻的获得及其稻瘟病抗性初步鉴定

将从小萝卜中分离的硫堇蛋白类基因RsAFP1通过基因工程的方法导入带有泛素Ubiquitin启动子及抗除草剂Bar基因的植物双元表达载体pCAMBIA1300中,经农杆菌介导对圣稻13进行遗传转化。对获得的阳性转基因植株进行稻瘟病菌体外及室内苗期稻瘟病菌接种抗性鉴定,结合田间自然发病情况,对转基因植株的抗稻瘟病性进行综合评价。初步结果表明,外源RsAFP1基因的导入可在一定程度上提高水稻对稻瘟病的抗性。

单粒精播对花生活性氧代谢、干物质积累和产量的影响

以小粒型花生品种花育23号为研究材料,在大田条件下对比研究了单粒精播技术对花生叶片活性氧代谢、群体地上部植株和荚果干物质积累动态和产量的影响。结果表明,单粒精播种植可提高SOD、POD和CAT等保护酶活性,降低膜脂过氧化物MDA含量,且单、双粒种植处理间差异达显著水平;花生单粒精播条件下,花生地上部植株和荚果的干物质积累动态相对稳定,干物质积累量和积累速率显著提高;SOD活性与地上部干物质积累速率显著相关,是影响花生干物质积累动态的主要抗氧化酶。本研究说明,单粒精播可通过影响花生花后活性氧代谢水平,尤其是SOD酶活性,延缓植株衰老进程,改善地上部群体和荚果的干物质积累动态,从而促进荚果产量的提高。

绒毛白蜡2个MYB转录因子的活性鉴定及其表达分析

绒毛白蜡(Fraxinus velutina Torr.)FvMYB1和FvMYB2基因分别属于R1-MYB和R2R3-MYB转录因子家族成员。通过酵母(Saccharomyces cerevisiae)单杂交系统分别对其转录活性进行了鉴定,并分析了2个基因在不同组织中的表达模式。酵母滤纸显色反应结果表明两个转录因子均能激活下游报告基因(His和LacZ)的表达,具有转录激活功能;β–半乳糖苷酶活性检测法定量分析得出FvMYB1和FvMYB2的半乳糖苷酶活性分别为14.55 U和20.80 U。组织特异性分析显示,两者在各组织(根、子叶、茎、叶)中均有表达,但各自又表现出不同的组织表达差异,其中FvMYB1基因在茎中表达量最高,根中最低;而FvMYB2基因在各组织中的表达量无明显差异。

花生蛋白激酶基因AhSTK的克隆与序列分析

从优质花生鲁花14的cDNA文库中发现一条序列,全长为1 399 bp,3'端含有polyA尾,通过blastx搜索得知其为蛋白激酶基因,命名为AhSTK。以该花生cDNA序列为模板设计引物,克隆得到花生Ah-STK基因。序列分析表明,AhSTK基因的开放阅读框长度为1 080 bp,编码359个氨基酸,预测其分子量为38.9 kD,等电点为6.42,编码的蛋白质无信号肽,无跨膜结构,预测定位于细胞质。与其他植物中蛋白激酶的氨基酸序列比对发现,与大豆GmSTK蛋白同源性最高。器官特异性分析发现,该基因在花生根中表达量较高,而在花中表达量较低。花生AhSTK基因的克隆为进一步研究其生物学功能和应用奠定了基础。

花生AhFAD2A基因启动子的克隆与序列分析

利用染色体步移技术,从花生品种鲁花14中克隆到716 bp的AhFAD2A基因启动子片段。序列分析表明,该启动子中含有多种种子特异性表达的元件,如GCN4基序、AGCCCA序列元件、Skn-1基序等,可能与AhFAD2A基因在种子中有较高的表达水平有关。启动子中预测的调控元件的功能还需进一步实验验证。

凋亡抑制蛋白基因dsRNA转基因烟草表达载体的构建

为了利用RNA干扰技术防治烟粉虱,需要构建凋亡抑制蛋白(IAP)基因dsRNA转基因烟草表达载体。利用PCR技术扩增烟粉虱IAP基因,将其连接到pMD18-T载体中,用BglⅡ、XhoⅠ和BamHⅠ、SalⅠ分别酶切,将获得的片段分别反向、正向连接至pUC-RNAi载体,用PstⅠ酶切pUC-RNAi-IAP,回收酶切片段,将其连接到表达载体pCAMBIA-2300-35S中,并进行酶切验证。IAPdsRNA转基因烟草表达载体的成功构建为下一步转基因烟草防治烟粉虱的研究奠定基础。

单子叶植物表达载体pUN3300的构建

植物双元表达载体在植物基因工程研究中具有重要作用,表达载体所包含的结构元件,如启动子、多克隆位点、筛选标记等,对植物遗传转化效率、外源基因表达强度及遗传稳定性等具有重要影响。本研究中,为提高目的基因对单子叶植物的遗传转化效率,对植物表达载体pCAMBIA3300进行改造,在原有以bar基因作为选择标记的基础上,采用不完全酶切的方法添加了Ubiquitin启动子,经酶切、测序表明,植物双元表达载体pUN3300构建成功。该载体对于研究外源基因功能、植物性状改良及新品种的培育,具有重要的价值。

小麦TaLTR基因的克隆及初步表达分析

以小麦山融3号为试验材料,克隆了TaLTR cDNA序列(Low temperature-responsive RNA-bind-ing protein)。序列分析表明,TaLTR序列包含完整的ORF区,编码蛋白含有162个氨基酸,其氨基端包含一个RRM(RNA recognition domain)超家族保守的结构域,羧基端则富含甘氨酸;经半定量RT-PCR分析,表明TaLTR参与低温、干旱、盐胁迫逆境反应。