山东部分地区毛皮动物肺炎克雷伯氏菌的分离鉴定及系统发育分析

为确诊近两年造成毛皮动物(狐狸、貉子、水貂)死亡的主要细菌性病原,本研究在流行病学调查基础上,对新鲜病死毛皮动物进行临床症状观察、病理学检查,同时取病变肝、肺、气管为样品分离纯化细菌,对所分离的细菌进行形态特征、理化特性检查及药敏试验、致病性试验和16S rRNA基因的分子鉴定。结果显示,从剖检病死毛皮动物的肺、肝、气管组织等均检出同种细菌,分离菌株对菌必治和舒巴坦高度敏感,对小白鼠具有较强致病作用,与已知的肺炎克雷伯氏菌16S rRNA序列的同源性为98.6%～100%。综合分析,该分离菌株为克雷伯氏菌属的肺炎克雷伯氏菌。

2016～2017年山东省三种亚型猪流感血清学调查

猪流感是一种人畜共患传染病,猪流感病毒(Swine influenza virus,SIV)在全世界各国的猪群中普遍存在。为了解山东省猪群中SIV的感染情况,2016年6月至2017年12月在山东省各地共采集7000份血清,采用HI抗体检测方法,分别用类禽型猪H1N1(EA H1N1)、2009甲型H1N1(2009/H1N1)和H3N2亚型抗原为标准抗原进行检测。结果显示,SIV抗体总阳性率为63.79%,其中EA H1N1抗体阳性率为56.31%,2009/H1N1抗体阳性率为24.61%,H3N2亚型抗体阳性率为1.61%。本研究结果表明2016~2017年山东省SIV感染比较普遍,类禽型猪H1N1抗体阳性率最高,2009甲型H1N1,H3N2抗体阳性率较低。

山东省某规模化兔场皮肤真菌病的快速诊断

为了鉴定某规模化兔场发生皮肤真菌病的病原,并为家兔皮肤真菌病的快速检测提供一种分子生物学方法。根据皮肤真菌特异性rDNA序列设计通用引物(5′-CACCGCCCGTCGCTACTAC-3′和5′-TTTCGCT-GCGTTCTTCAT-3′),对已知分离株及其他微生物等进行特异性检测;应用该引物对所采取的种兔患部病料35份和临床健康种兔的样本5份,进行PCR检测并克隆测序。该引物对四种常见病原性皮肤真菌分离菌株扩增出一条在400bp-500bp之间的条带,其中红色毛癣菌和须癣毛癣菌为460bp,犬小孢子菌500bp,石膏样小孢子菌为400bp,但对其它微生物和兔体细胞均未扩增出类似片段,说明具有特异性;对临床35份病料中的33份均扩增出一条460bp条带,为毛癣菌属,与测序结果一致。健康种兔的样品未扩增出类似片段。本研究利用通用引物对家兔皮肤真菌病进行PCR检测并确定其主要病原,具有快速、简便和特异性强等特点,可用于大规模的家兔皮肤真菌病的诊断,并具有重要的公共卫生意义。

规模化羊场生物安全体系的建立与羊疫病控制实施方案

近年来,我国养羊业也紧随其他养殖业的蓬勃发展,初步朝向规模化、集约化、现代化的水平迈进,但是,养羊业和其他养殖业（特别是养禽业和养猪业）相比,在疾病控制水平上还存在着明显的差距。更由于一些养羊场（户）防病理念的落后,忽视养殖环境控制和改善,忽视防疫工作,滥用抗生素、化学药物,过分依赖疫苗等,导致羊的发病率与死淘率升高,防治难度加大,疾病变得更加复杂化,使养羊业遭受较大的经济损失,挫伤了养羊者的积极性。针对规模化养羊业发展的初期，如何为羊产业的健康发展保驾护航，控制好疫病是第一位的，怎样控制疫病，采取什么羊的理念至关重要。

不同动物种源肺炎克雷伯氏菌分离株23S rRNA序列分析

为分析动物种源肺炎克雷伯氏菌分离株（K．p妇）的进化特点，本研究通过PCR扩增不同动物种源K．pn的23SrRNA基因片段，克隆测序，进行BLAST比对；构建K-pm菌株的系统进化树。结果显示，本实验室保存的12株K．p力核苷酸序列与GenBank收录的X87284株K-pm核苷酸序列同源性为96．8％～99．0％，而与沙门氏菌和奇异变形杆菌同源性只有90．0％～92．7％；8株毛皮动物K．加核苷酸序列同源性为98．1％～99．9％，与猪源、鸡源K．p力的核苷酸序列同源性分别为95．5％～98．1％、96．7％～97．9％；猪源与鸡源K．pn的核苷酸序列同源性为95．9％～97．4％。结果表明，不同动物种源K-pn23SrRNA基因序列同源性差异明显，具有种属的特异性，23SrRNA基因序列可以作为鉴定K-pm的一种快速、简便的方法。

禽波氏杆菌外膜蛋白A的克隆测序与生物信息分析

本文旨在克隆禽波氏杆菌外膜蛋白OmpA的编码基因,并预测OmpA蛋白二级结构和B细胞抗原表位,从而探讨禽波氏杆菌外膜蛋白OmpA在免疫保护中所起的作用。作者对禽波氏杆菌的外膜蛋白ompA基因进行PCR扩增、克隆及序列测定。应用生物信息学相关软件和方法,对禽波氏杆菌OmpA蛋白的二级结构和B细胞抗原表位进行预测。禽波氏杆菌ompA基因全长597bp,编码199个氨基酸。二级结构以无规卷曲为主,有少量的α-螺旋和β-片层,少见β-转角;推测OmpA蛋白有5个B细胞优势抗原表位区域、2个糖基化位点。本研究为进一步分析禽波氏杆菌免疫机理、制备单克隆抗体和设计表位疫苗等奠定理论基础。

2011年～2013年山东地区规模化养猪场猪体携带病原调查与分析

为了解山东地区2011年-2013年猪体携带病原情况,本研究对发病猪场送检的264份病料样品进行病原检测,结果显示发病猪体内主要病原及其分离率分别为：猪繁殖与呼吸综合征病毒43.18%,流行性腹泻病毒27.27%,猪圆环病毒31.64%,猪传染性胸膜肺炎放线杆菌58.33%,副猪嗜血杆菌26.42%,大肠杆菌32.85%,支气管败血波氏杆菌3.12%,绿脓杆菌2.51%。表明引起呼吸系统疾病的病原分离率较高,是导致猪场高发病率与死亡率的重要原因。本研究为有效并针对性地控制相关地区规模化猪场疫病提供了重要数据依据。

不同的季节和饲养方式对鸡蛋微生物指标的影响

为了解饲养方式和季节因素对鸡蛋微生物指标的影响,本研究对地方鸡种济宁百日鸡在夏、秋和冬3个季节以及笼养和散养两种饲养方式下所产鸡蛋的微生物指标进行了测定分析。结果发现,济宁百日鸡散养组蛋壳3个季节平均的总细菌、大肠杆菌和沙门氏菌的带菌率分别为100%、71%和6.7%,而笼养组分别为100%、36%和2.7%;散养组蛋清3个季节平均的的总细菌、大肠杆菌和沙门氏菌的带菌率分别为37%、12%和4%,而笼养组分别为25%、5.3%和1.3%。同一季节鸡蛋蛋壳上的总细菌、大肠杆菌和沙门氏菌的带菌率明显高于蛋清。不管是散养组还是笼养组,随着由夏季到冬季的推移,鸡蛋蛋壳和蛋清的总细菌的带菌率和菌落数、大肠杆菌的带菌率和菌落数和沙门氏菌的带菌率和菌落数大部分指标呈现逐渐降低的趋势。

山东地区羊绿脓杆菌的分离鉴定及系统发育分析

近两年,山东省规模化羊场羊患慢性化脓性肺炎病例频繁出现,为了探明其病原及特点,在流行病学调查基础上,对山东省6个地区10个规模化羊场的病、死羊进行临床症状观察、病理学检查,对所分离的菌株进行形态特征、理化特性检查及药敏试验、致病性试验和16S rRNA基因的分子鉴定。结果显示:从剖检病死羊的肺、肝、气管等组织中分离出6株细菌(分别命名为PA1~PA6),分离菌株镜检均为革兰氏阴性、短杆菌,对庆大霉素高度敏感,对小白鼠具有较强致病作用。综合流行病学和生化试验结果等判定,该6株分离菌均为绿脓杆菌。对6株绿脓杆菌16S rRNA序列分析表明,该6株分离菌与已知的绿脓杆菌16S rRNA序列的同源性为99.9%~100%,与报道的绿脓杆菌菌株B136-33、YMD-4以及LCQ-4的序列位于一个分支上,属于一个亚群,其中与北京株B136-33的进化关系更近,核苷酸同源性为100%。

山羊鲍曼不动杆菌分离鉴定和病原性研究

为鉴定2013年初造成山东潍坊某羊场羊群发病的病原,本研究从患病山羊器官中分离到2株致病细菌,对分离的菌株经形态特征、生化试验及致病性试验进行鉴定,并通过分离菌株16S rRNA基因序列比较和系统发育分析。鉴定结果表明分离株为鲍曼不动杆菌;此外,16S rRNA基因同源性比对分析显示2株分离菌株核苷酸序列之间同源性为100%,与参考菌株NC009085株(人源)鲍曼不动杆菌标准菌株核苷酸序列同源性为100%,与绵羊源、牛源、鹅源鲍曼不动杆菌参考菌株核苷酸序列同源性分别为100%,99.9%,99.9%;耐药性结果显示其仅对舒巴坦和强力霉素敏感,致病性试验结果显示其对小鼠具有较强的致病作用。该分离株与人源、绵羊源、牛源和鹅源鲍曼不动杆菌的亲缘关系较近,可能为人畜共患病病原菌。

山东规模化养殖场毛皮动物多重感染病原学分析

2012—2013年间,山东10个地市多家毛皮动物养殖场养殖的毛皮动物(狐狸、貉子、水貂)出现腹泻,皮肤湿疹,神经症状,空怀、流产、出血性肺炎等症状和病变类似的疫情,为探明其病因,本研究对发病规模化毛皮动物养殖场发病情况进行调查,并对送检的病料进行病原学检查,结果发现,犬瘟热病毒、细小病毒、阿留申病毒感染率分别为54.21%、47.30%、31.35%;肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌、肺炎双球菌、大肠杆菌、沙门杆菌、绿脓杆菌、加德纳菌的感染率分别为37.58%、25.05%、21.81%、14.04%、12.53%、10.37%、8.21%;犬瘟热病毒、细小病毒、阿留申病毒、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌、肺炎双球菌6种病原的单独感染、二重感染、三重感染、四重感染分别为22.03%、39.52%、36.07%、2.38%,未见五重以上的感染。结果表明,近两年造成山东规模化场毛皮动物发病主要原因是由犬瘟热病毒、细小病毒、阿留申病毒与肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌、肺炎双球菌多重感染所致,这为规模化毛皮动物养殖场有效地控制疫病提供了理论依据。

鸡胚胎性病原菌多重PCR检测方法的建立

为建立同时检测禽波氏杆菌(Bordetella avium)、沙门氏菌(Salmonella)、大肠杆菌(Escherichia coli)和绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)4种导致鸡胚死亡病原菌的多重PCR方法,本研究根据B.avium的ompA基因、Salmonella的invA基因、E.coli的phoA基因和P.aeruginosa的toxR基因序列,各设计一对特异性引物进行多重PCR反应,并对反应体系和条件进行优化。结果显示,4对引物分别扩增出597bp、724bp、372bp和278bp的目的条带;并且特异性强不与其他非目的菌发生反应。经优化B.avium、P.aeruginosa和E.coli多重PCR检测灵敏度达到104cfu/mL,而Salmonella为103cfu/mL。本研究建立的多重PCR方法为相关病原菌的快速检测提供方法。

山羊奇异变形杆菌分离鉴定及其16S-23SrRNAISR序列RFLP分析

2012年初,山东菏泽某羊场的羊群发病,从发病羊器官分离到2株病原细菌。对病原细菌进行鉴定,并对其与已知同种异源菌株相似性差异进行分析。从患病山羊内脏器官分离细菌,经形态特征、培养特性、生化试验、血清学试验及致病性试验进行鉴定;再通过设计通用引物扩增16S-23SrRNA ISR(intergenic spacer region)序列,将PCR产物经HinfⅠ单酶切获得3条可视条带,同时对扩增条带中的主带测序并进行系统发育分析。结果表明,分离菌株为奇异变形杆菌;分离菌株同本实验室保存的兔源与鸡源奇异变形杆菌PCR-RFLP结果一致;分离菌株PCR产物同GenBank收录的HI4320株奇异变形杆菌及本实验室保存的兔源与鸡源奇异变形杆菌进行序列比较,分离羊源菌株与兔源菌株相似性为94.8%、与鸡源菌株相似性为96.0%～98.2%,与人源HI4320株相似性为96.9%。研究证实发病羊致病病原为奇异变形杆菌,其与鸡源、兔源和人源奇异变形杆菌的亲缘关系较近。

皖南黄肉种鸡种蛋中禽白血病病毒的感染状态检测

本研究首次通过检测种蛋中禽白血病病毒（ALV）评价了皖南黄父母代肉种鸡的ALV感染状态。收集该鸡群的120枚鸡蛋,取40枚鸡蛋孵化至9~11 d后分别制备CEF,培养10 d,取细胞上清用ELISA试剂盒检测ALV p27抗原。另取80枚鸡蛋卵白直接检测p27抗原,同时分别将80枚鸡蛋卵白接种CEF（DF1）,培养10 d后取细胞上清检测p27抗原。比较p27阳性检出率的结果表明,受精蛋孵化9~11 d后制备CEF,再培养10 d的细胞上清检出率（10/36）高于直接检测卵白（17/80）与卵白接种CEF（DF1）的细胞上清（7/80）。将经DF1培养后p27抗原阳性样品,用针对ALV-J的单抗JE9做IFA,ALV-J的阳性率为6/7。检测该80枚鸡蛋的卵黄抗体,ALV-J、ALV-AB的抗体阳性率分别为18/80、1/80。结果表明,该皖南黄父母代肉种鸡群存在的外源性ALV感染主要为ALV-J。该研究为ALV的净化提供了可行性检测方法。

芦荟粗提物抑菌及抗病毒作用的研究

为研究芦荟粗提物对多种常见畜禽致病菌和病毒的体外抑菌和抗病毒作用,本实验采用培养基打孔法观察芦荟粗提物对致病菌的抑菌作用;采用含不同浓度芦荟粗提物的固体培养基培养致病菌观察其抑菌效果;采用细菌计数法分析致病菌在芦荟粗提物液体培养基中的增殖情况。分别采用细胞培养和鸡胚接种法检测不同浓度芦荟粗提物以及不同作用时间对传染性囊病病毒(IBDV)和新城疫病毒(NDV)增殖的抑制作用。结果表明:芦荟粗提物对供试菌均具有抑菌作用,其中金黄色葡萄球菌、四联球菌、八叠球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、蜡样芽胞杆菌培养时出现明显的抑菌圈,直径(D)>14 mm;固体培养基中芦荟粗提物浓度大于40%时可形成可明显地减少菌落数;浓度大于80%的液体培养基中细菌生长到达对数期的时间比对照组延长至少4 h。IBDV与芦荟粗提物作用组的MTT OD570nm值均高于病毒对照组,并且随浓度的增大和时间的延长而升高;NDV与芦荟粗提物作用组的血凝价均低于病毒对照组,并且随浓度的增大和作用时间的延长而降低。

布鲁氏菌病的研究进展

布鲁氏菌病(Brucellosis)简称布病,又称马耳他热,是由布鲁氏菌引起的人畜共患性传染病。主要引起人的波状热和慢性感染,引起怀孕母畜流产、死胎,公畜发生睾丸炎等,给人的健康和畜牧业的发展带来严重危害。本病流行于世界各地,主要发生在牛羊养殖国家和地区,包括经济不发达的亚非地区,以牛羊为主的穆斯林地区和文化技术落后的地区等,而我国布鲁氏菌病疫情则从内蒙、东北等牧区逐渐向南方扩散。本文从布鲁氏菌的病原学研究、致病机理、流行病学、临床症状及剖检变化、诊断和防治措施等方面进行介绍,并结合我国的实际情况对科学防控牛羊布鲁氏菌病提出了建议。

乳酸菌微生态制剂对肉鸡生产性能及免疫机能的影响

本实验利用乳酸菌微生态制剂饲喂AA肉鸡,通过检测鸡增重、料重比、免疫器官指数、抗体效价以及盲肠内容物的乳酸菌和大肠杆菌数量,探索乳酸菌微生态制剂对肉鸡生产性能及免疫功能的影响。首先将150只肉鸡随机分成3组,第1组在饮水中添加0.3%的乳酸菌微生态制剂,第2组添加抗生素饮水,第3组为空白对照组,7日龄时接种新城疫疫苗;于每周末称取各组鸡的体重、耗料,计算增重和耗料量;在21日龄和35日龄时,采取各组鸡的脾脏、法氏囊和胸腺、分别计算免疫器官指数;用HI和微量平板滴种法分别检测抗体效价和盲肠内容物乳酸菌、大肠杆菌数量。结果显示,添加0.3%乳酸菌微生态制剂组与对照组和抗生素组鸡比较,分别提高鸡体重15.55%和8.57%(差异显著P<0.05),料重比分别降低5.11%和4.57%;于21日龄和35日龄时检测发现,添加0.3%乳酸菌微生态制剂组与对照组鸡比较,脾脏、法氏囊和胸腺指数分别提高了44.26%1、3.51%、33.96%和67.14%、16.47%3、8.16%;抗体水平分别升高了1.8log2和2 log2,差异显著(P<0.05),与抗生素组比较,抗体效价分别提高了1.4log2和1.75log2,差异显著(P<0.05);另外,21日龄和35日龄时,与对照组比较,添加0.3%乳酸菌微生态制剂鸡盲肠内容物中乳酸菌数量分别增加1.28log2和0.27log2,差异显著(P<0.05),同时分别使大肠杆菌数量减少1.88log2和0.84log2,差异显著(P<0.05)。本研究为合理开发利用乳酸菌微生态制剂提供了理论依据和技术支持。

蛋种鸡ALV-J与REV共感染病变新特点

2009年8月,山西榆次某鸡场蛋种鸡群产蛋量急剧下降,部分鸡产蛋停止。病理组织学观察发现,病鸡肝脏、肾脏、肺脏、心肌等组织中出现小灶状淋巴细胞瘤,肿瘤细胞为成熟的淋巴细胞;聚合酶链式反应(PCR)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和间接免疫荧光(IFA)检测显示,被检鸡ALV-J感染率为8/8,而且7/8为病毒血症,与REV共感染率为2/8,未出现REV单感染;从发病情况看,淋巴细胞瘤均出现于共感染病例,特别是ALV-J病毒血症的共感染鸡病变最为严重,但未见ALV-J的特征性髓细胞瘤。囊膜蛋白氨基酸同源性分析显示,ALV-J毒株与英国HPRS-103原型株同源性最高(96.9%以上),共感染的REV毒株与suv-env株同源性最高(93.8%)。本病例揭示,先天传播的ALV-J引起的病毒血症状态可能为REV的致瘤创造了环境,使临床罕见的REV淋巴瘤早于髓细胞瘤出现,因此,严格种鸡群的ALV-J净化是防控此病的重中之重。对于ALV-J与REV协同的机制还需进一步研究。

禽白血病病毒J亚群诱导蛋鸡群多种肿瘤

2009年8月,山东泰安某海兰褐商品蛋鸡场,开产后产蛋率只有60%～70%,31周龄时,死亡率突然增加,最高达20%。患病鸡经大体剖检、病理组织学、PCR和免疫组织化学检测确诊为J亚群禽白血病。病理组织学检测发现送检鸡除了髓细胞瘤外,还存在明显的纤维肉瘤、组织肉瘤、腺癌和血管内皮瘤等肿瘤。纤维肉瘤单独存在,组织肉瘤、腺癌和血管内皮瘤分别和髓细胞瘤混合存在,本文详细描述了各肿瘤的组织学特点。ALV-J从肉种鸡传向商品蛋鸡后引起肿瘤谱扩展的原因和机制值得进一步研究。

鸭圆环病毒Cap基因在昆虫细胞杆状病毒系统中的表达及鉴定

通过PCR方法扩增完整的鸭圆环病毒Cap基因,按正确的阅读框架将其克隆入pFastBacTM HTB杆状病毒载体,将筛选的阳性重组载体pF-CP转化至含有杆状病毒穿梭载体和辅助载体的DH10Bac大肠杆菌感受态细胞,经过蓝白斑筛选和PCR鉴定,获得重组表达载体rBacmid-CP。在脂质体的介导下转染Sf9昆虫细胞,72h后获得重组杆状病毒。Western blot和间接免疫荧光(IFA)试验结果表明,表达的蛋白与原核表达Cap蛋白免疫小鼠采集的血清具有良好的反应原性,为进一步研究Cap蛋白的功能奠定基础。