Ezrin的原核表达及与其相互作用蛋白的研究

目的体外筛选人胰腺癌细胞中与Ezrin蛋白相互作用的蛋白。方法提取人胰腺癌Panc-1细胞总RNA,RT-PCR法扩增Ezrin基因。将扩增得到的Ezrin基因片段和pET15b质粒转化E.coli DH5α,获得pET15b-Ezrin重组质粒,双酶切后测序鉴定。将测序正确的重组质粒转化至E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL,以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,对表达产物进行Ni2+-NTA亲和层析和分子筛纯化后,行SDS-PAGE、MALDI-TOF-MS/MS质谱分析和蛋白质印迹鉴定。裂解Panc-1细胞,获得总蛋白提取液,采用Pull-down方法体外筛选与Ezrin重组蛋白相互作用的蛋白,并对筛选出的目的蛋白进行双向凝胶电泳和MALDI-TOF-MS/MS质谱鉴定。结果RT-PCR扩增出的Ezrin基因片段(1761bp)与理论DNA表达片段大小一致,测序鉴定显示克隆的Ezrin基因序列与GenBank报道序列相符。SDS-PAGE、质谱分析和蛋白质印迹分析显示纯化后Ezrin重组蛋白相对分子质量为69400,与质谱分析的相对分子质量结果相符,为带有His-6标签的特异蛋白。双向凝胶电泳和质谱鉴定结果共筛选出可与Ezrin重组蛋白相互作用的7种蛋白,其分别为RNA-binding motif protein39(RBM39)、Transgelin(TAGLN)、Albumin(ALBU)、Formin-1(FMN1)、Rho GTPases(RHGBA)、Tetratricopeptide repeat protein16 (TTC16)、Syntaxin-binding protein1(STXBP1)。结论在大肠杆菌中成功表达、纯化了Ezrin蛋白,并在体外成功筛选出可信的与Ezrin蛋白相互作用的蛋白。

组织工程材料捕获成体干细胞的影响因素研究

目的探索体内埋植组织工程材料方法获取成体干细胞的相关影响因素。方法BALB/c小鼠随机分为2组,分别埋植经环氧乙烷灭菌的明胶海绵与聚乳酸,在植入后第3、7、14天时分别取出材料,HE染色观察细胞捕获情况。将埋植相同质量明胶海绵的小鼠随机分为成骨蛋白-1(OP-1)组、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)组和对照组,在植入后第3、6、9、12、15天时分别取出材料,称取质量并进行细胞计数,采用流式细胞术检测第12天时分离获得的各组细胞表面CD34和干细胞抗原-1(Sca-1)的阳性表达率。另取第12天时分离获得的对照组细胞,分为OP-1组、G-CSF组和空白对照组,采用噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖活性。结果HE染色显示,明胶海绵与聚乳酸捕获的细胞数量均随时间延长而增加。各组植入的明胶海绵质量均随时间延长而减少,而捕获细胞数量均随时间延长而增加,OP-1组第9、12、15天和G-CSF组第9天时捕获细胞数量分别与对照组相比均有统计学意义(均P<0.05);OP-1组细胞表面CD34、Sca-1单阳性表达率和双阳性表达率(分别为13.07%±0.19%、3.98%±0.15%、17.02%±0.12%)均明显高于对照组(分别为11.62%±0.44%、3.03%±0.11%、2.91%±0.14%,均P<0.05),G-CSF组细胞表面CD34、Sca-1单阳性表达率(分别为12.79%±0.39%、4.52%±0.35%)分别与对照组相比均无统计学意义,但双阳性表达率(10.21%±0.15%)与对照组相比有统计学意义(P<0.05)。MTT检测结果显示,OP-1组和G-CSF组各时间点测定的吸光度值均高于空白对照组(均P<0.05)。结论通过体内埋植复合OP-1明胶海绵的方法可增加干细胞的捕获数量,为建立一种简易提取自体干细胞的新方法奠定了基础。