不同浓度二十二碳六烯酸对正常大鼠冠状动脉平滑肌细胞BK通道的激活作用及其机制

目的:探讨不同浓度二十二碳六烯酸(DHA)对正常大鼠冠状动脉平滑肌细胞大电导钙激活钾离子通道(BK通道)的激活作用及其机制。方法:酶消化法分离正常大鼠冠状动脉平滑肌细胞。采用全细胞膜片钳实验技术记录在未孵育与孵育细胞色素P450环氧化酶抑制剂SKF525A并灌流不同浓度DHA条件下BK通道电流密度变化;采用单通道膜片钳实验技术记录灌流不同浓度DHA时BK单通道开放概率的变化。结果:0.01~1.00μmol/L(定义为低浓度)DHA激活BK通道的半效浓度(EC50)为(0.24±0.05)μmol/L,但经SKF525A孵育后激活作用消失;3.00~10.00μmol/L(定义为高浓度)DHA激活BK通道的EC50为(2.38±0.22)μmol/L,经SKF525A孵育后,激活作用仍存在,且EC50无明显变化。在电极外液钙离子浓度为1μmol/L和刺激电位60 m V条件下,DHA浓度为0、0.01、0.03、0.10、0.30、1.00μmol/L时,BK通道开放概率分别为(0.095 2±0.009 5)、(0.093 9±0.012 6)、(0.098 6±0.016 9)、(0.099 5±0.014 7)、(0.097 5±0.010 4)和(0.102 3±0.020 6)(P>0.05,n=5),提示低浓度DHA不能激活BK单通道;继续增加DHA浓度,当浓度为3、10μmol/L时,BK单通道开放概率分别为(0.700 3±0.013 2)和(0.892 7±0.052 3)(P<0.05,n=5),提示高浓度DHA呈浓度依赖性激活BK单通道,EC50为(3.37±0.10)μmol/L。结论:不同浓度DHA激活BK通道的机制不同,低浓度DHA通过细胞色素P450环氧化酶途径激活BK通道,高浓度DHA可能通过与BK通道结合后直接激活。

微量元素铜、锌对实验性动脉粥样硬化形成和消退的影响

本文研究铜锌比值不同的饲料对实验性动脉粥样硬化形成和消退的影响。在“形成”实验末和“消退”实验末,低铜锌比饲料组与高铜锌比饲料组相比,血清铜值较小,锌值较大、铜锌比值较小、总胆固醇值较大、高密度脂蛋白胆固醇值较小,动脉粥样硬化程度较重,各项对比均有显著或非常显著差异。“形成”实验末有关数据的相关性检验证实,铜锌比值与总胆固醇值,铜锌比值与总胆固醇/高密度脂蛋白胆固醇比值,总胆固醇值与动脉粥样硬化的斑块计分值,均呈非常显著的相关关系(P<0.01)。本文认为,微量元素铜与锌,特别是铜锌比值,通过影响脂质代谢而影响动脉粥样硬化,低铜锌比饲料加重动脉粥样硬化。

正常大鼠冠状动脉平滑肌细胞钾离子通道的组成及二十二碳六烯酸的激活作用

目的探讨正常大鼠冠状动脉平滑肌细胞钾离子通道的组成及二十二碳六烯酸（DHA）的激活作用。方法采用酶消化法急性分离正常大鼠冠状动脉平滑肌细胞，以全细胞膜片钳技术记录灌流不同钾离子通道阻滞剂后钾离子通道电流的变化，以及DHA灌流后钾离子通道电流变化。结果未加阻滞剂时，5μmol／LDHA灌流后钾离子通道电流明显增加，在刺激电压为100mV时，DHA灌流前后的电流密度分别为（52．80±6．68）和（110．09±13．39）pA／pF（P〈0．05）。在非特异性钾离子通道阻滞剂四乙胺10mmol／L作用下，DHA灌流不能激活钾离子通道。与未灌流时基础状态比较，在大电导钙激活钾离子通道特异性阻滞剂ibritoxin100nmol／L、中电导钙激活钾离子通道阻滞剂TRAM-34200nmol／L、小电导钙激活钾离子通道阻滞剂apamin1μmol／L、电压依赖性钾离子通道阻滞剂4-aminopyridine5mmol／L和ATP依赖性钾离子通道阻滞剂glyburide10μmlol／L作用下，钾离子通道电流密度分别减少47．6％、12．4％、13．6％、41．5％和0．1％，再同时灌流DHA后钾离子通道电流密度分别增加32．4％、124．2％、108．5％、149．5％和144．7％。结论大电导钙激活钾离子通道与电压依赖性钾离子通道为正常大鼠冠状动脉平滑肌细胞上分布的主要的钾离子通道。DHA可激活冠状动脉平滑肌细胞钾离子通道，其中主要为大电导钙激活钾离子通道，这可能是DHA扩张冠状动脉、保护心血管系统的机制之一。

硫氮酮对冠心病患者低密度脂蛋白氧化修饰作用的影响

采用病例对照及用药前后自身对照的方法，测定30例冠心病患者（冠心病组）及30例健康人（对照组）氧化低密度脂蛋白（oxLDL）、脂质过氧化物（LPO）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH－Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL－C），并计算低密度脂蛋白胆固醇（LDL－C），以观察硫氮酮对冠心病患者低密度脂蛋白氧化修饰作用及有关指标的影响。结果：冠心病组oxLDL、LPO较对照组显著升高（P＜0.01），GSH－Px显著降低（P＜0．01），应用硫氮酮治疗后oxLDL、LPO较治疗前显著降低（P＜0．01，＜0．05），GSH－Px显著升高（P＜0．01）。结论：硫氮酮具有良好的氧自由基清除作用，其抑制低密度脂蛋白的氧化修饰是防治冠心病的机理之一。

二十二碳六烯酸通过磷脂酶C-三磷酸肌醇-钙离子途径激活正常大鼠冠状动脉平滑肌细胞BK通道

目的探讨二十二碳六烯酸（DHA）激活正常大鼠冠状动脉平滑肌细胞大电导钙激活钾通道（BK通道）的机制。方法采用酶消化法急性分离正常大鼠冠状动脉平滑肌细胞；全细胞膜片钳实验技术记录正常大鼠冠状动脉平滑肌细胞BK通道电流；膜内向外型单通道膜片钳实验技术记录不同钙离子浓度条件下BK通道电流，并计算开放概率（NP1）；钙离子成像技术测定不同浓度DHA作用后及分别采用磷脂酶（CPLC）受体抑制剂和三磷酸肌醇（IR）受体抑制剂预孵育冠状动脉平滑肌细胞后细胞内钙离子浓度变化。结果1μmol／LDHA可激活BK通道；在刺激电位60mV，电极外液钙离子浓度为0、0．01、0．1、1、3、10、50和100μmol／L条件下，BK通道NP。分别为0．0027±0．0004、0．0060±0．0014、0．0972±0．0106、0．1379±0．0329、0．4687±0．1637、2．0971±0．3104和3．1204±0．2427（P〈0．05，n=4）。未加DHA时，细胞内钙离子浓度荧光信号比值（R值）为0．51±0．01；加入0．001和0．01μmol／LDHA后，R值分别为0．53±0．02和0．55±0．01，与未加DHA相比差异无统计学意义（P〉0．05，n／〉5）；当加入的DHA浓度为0．1、0．3、1、3、5和10μmol／L时，其R值分别为0．64±0．01、0．65±0．01、0．70±0．01、0．69±0．01、0．68±0．01和0．67±0．02，ECEn为（0．04±0．02）μmol／L，与未加DHA比较，差异有统计学意义（P〈0．05，nI〉4）。分别采用PLC受体抑制剂U73122和IR受体抑制剂2-APB预孵育冠状动脉平滑肌细胞，测定加入0．1μmol／LDHA后R值分别为0．52±0．01和0．49±0．02，低于未加抑制剂的R值（0．64±0．01，P〈0．05，n≥4）。结论DHA可通过PLC—IP，Ca^2＋途径增加正常大鼠冠状动脉平滑肌细胞内钙离子浓度激活BK通道，从而扩张血管，对心血管系统有一定的保护作用。

瞬时受体电位C1通道在糖尿病大鼠冠状动脉平滑肌细胞上的表达及对细胞内钙离子浓度的影响

目的 探讨瞬时受体电位C1通道（TRPC1）在糖尿病大鼠冠状动脉平滑肌细胞中的表达变化及对糖尿病冠状动脉功能影响的可能机制.方法 选用8~12周龄、体重（200±20）g的健康雄性SD大鼠160只,采用随机数字表法随机分为正常对照组（80只）和糖尿病组（80只）.采用腹腔链脲佐菌素注射建立1型糖尿病大鼠动物模型;采用酶消化法急性分离正常和糖尿病大鼠冠状动脉平滑肌细胞;采用Western blotting和实时荧光定量PCR分别测定正常组和糖尿病组冠状动脉TRPC1通道蛋白和基因的表达;采用细胞内钙离子荧光成像技术测定正常和糖尿病大鼠冠状动脉平滑肌细胞内钙离子浓度及加入TRPC1通道阻滞剂SKF96365后细胞内钙离子浓度的变化;采用血管张力测定技术测定TRPC1通道阻滞剂SKF96365对糖尿病冠状动脉功能的影响.2组间比较采用t检验.结果 糖尿病组冠状动脉平滑肌细胞上TRPC1通道蛋白表达量是正常组的（1.456±0.081）倍（t=-2.210,P〈0.05）;糖尿病组TRPC1通道基因表达量为正常组的（2.198±0.251）倍（t=-3.864,P〈0.05）;糖尿病组较正常组钙离子浓度变化增加（1.217±0.044比0.869±0.029,t=-6.644,P〈0.05）,正常组加入SKF96365后较加入前钙离子浓度减低（0.067±0.039比0.842±0.020,t=15.726,P〈0.05）,糖尿病组加入SKF96365后较加入前钙离子浓度减低（0.195±0.028比1.217±0.043,t=-19.807,P〈0.05）;正常组和糖尿病组冠状动脉在ET-1收缩血管后,加入10μmol/L TRPC1通道抑制剂SKF96365,糖尿病组较正常组冠状动脉舒张的百分比明显升高[（91.6±2.6）%比（69.2±6.0）%,t=-3.529,P〈0.05].结论 糖尿病时冠状动脉平滑肌细胞上TRPC1通道表达增加,细胞内钙离子浓度增加,导致血管收缩和功能紊乱,这可能是糖尿病患者易发生冠状动脉病变的机制之一.

MiR-200b对1型糖尿病大鼠胸主动脉炎症基因表达的影响

目的 探讨1型糖尿病大鼠胸主动脉miR-200b的变化及对炎症基因表达的影响.方法 研究分为正常对照组和糖尿病组.通过对SD大鼠腹腔注射链脲佐菌素构建1型糖尿病大鼠动物模型,采用qRT-PCR和Western印迹方法测定1型糖尿病大鼠胸主动脉miR-200b、炎症基因环氧化酶-2（COX-2）、单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素6（IL-6）及miR-200b靶基因转录抑制因子Zeb1的表达.结果 qRT-PCR显示糖尿病组大鼠胸主动脉miR-200b的表达较正常对照组明显上调（4.587±1.261对1.728±0.372,P＜0.05）;炎症介质COX-2、MCP-1、TNF-α和IL-6的表达量显著升高（3.808±1.294对0.864±0.093, P＜0.05;3.203 ±0.402对1.485 ±0.433, P＜0.01;2.288 ±0.480对0.784±0.089,P＜0.01;6.334±2.683对0.981 ±0.176,P＜0.05）;Western印迹显示正常对照组和糖尿病组Zeb1表达水平分别为0.496±0.031和0.264±0.012 （P＜0.01）,糖尿病组较正常对照组下降46.7％.结论 1型糖尿病时大鼠胸主动脉中miR-200b上调,并抑制靶标Zeb1表达,进而增加调控通路下游相关炎症基因的表达,这可能是糖尿病血管并发症发生发展的重要机制之一.

糖尿病大鼠冠状动脉平滑肌细胞大电导钙激活钾通道特性及开放动力学的变化

目的研究糖尿病时冠状动脉平滑肌细胞大电导钙激活钾通道(BK通道)的电压依赖性、钙敏感性及其开放动力学变化,探讨糖尿病时冠状动脉损伤的细胞电生理机制。方法采用链脲霉素腹腔内注射建立糖尿病大鼠模型(糖尿病组,n=30),对照组相应注射生理盐水(n=30);采用酶消化法急性分离大鼠冠状动脉平滑肌细胞;采用膜内向外型单通道膜片钳实验技术记录BK单通道电流;采用Clampfit 10.4软件分析单通道数据。结果在电极外液钙离子浓度为1mmol/L,刺激电位分别为0,20,40,60,80,100,120和140mV时,随着刺激电位增加,正常组BK通道的NPo逐渐增加,其半数有效激活电压(V1/2)为(88.45±1.72)mV;糖尿病组BK通道NPo亦逐渐增加,V1/2为(104.29±1.09)mV,其电压-NPo曲线较正常组向左下移动。在刺激电位60 mV,电极外液钙离子浓度分别为0,0.01,0.1,0.5,1,5,10和50mmol/L时,随着电极外液钙离子浓度增加,正常组BK通道NPo逐渐增加,其半数有效激活浓度(EC50)为(2.26±0.27)mmol/L;糖尿病组BK通道NPo亦逐渐增加,EC50为(3.15±0.20)mmol/L,其浓度-NPo曲线较正常组向左下移动。在电极外液钙离子浓度为1mmol/L,刺激电位60 mV时,与正常组比较,糖尿病组BK通道NPo明显减少,电流幅度与平均开放时间无明显变化,而平均关闭时间显著延长[(451.35±113.71)ms vs(107.58±15.99)ms,P<0.05]。结论糖尿病时冠状动脉平滑肌细胞BK通道电压依赖性与钙敏感性均受损,开放概率减少,通道平均关闭时间延长,这可能是糖尿病冠状动脉功能损伤的重要原因之一。

n-3多不饱和脂肪酸对正常大鼠冠状动脉平滑肌细胞大电导钙激活钾通道的激活作用及其机制

目的探讨n-3多不饱和脂肪酸（n-3PUFA）对正常大鼠冠状动脉平滑肌细胞大电导钙激活钾通道（BK通道）激活作用及其机制。方法酶消化法分离正常大鼠冠状动脉平滑肌细胞，采用膜内向外型单通道膜片钳实验技术分别记录不同浓度二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）灌流后BK通道开放概率（NP0）。采用Western Blot和qRT-PCR分别测定未灌胃组和低、高剂量n-3 PUFA灌胃组大鼠冠状动脉平滑肌细胞BK通道α亚单位和β1亚单位基因及蛋白表达。结果在电极外液钙离子浓度为1μmoVL和刺激电压60mV条件下，EPA浓度为0、10、30、100、300和1000pmo/L时，BK通道NP0分别为0．0616±0．0938、0．1090±0．0957．0．1303±0．0964、0．2250±0．1804、0．3803±0．2472和0．4080±0．2705，呈浓度依赖性增加（P〈0．05，n=4）；而DHA浓度为0、0．01、0．1和1μmol/L时，BK通道NP0分别为0．1200±0．0086、0．1190±0．0734、0．1250±0．0921和0．2890±0．0616，NP。无明显增加（P〉0．05）；继续增加DHA的浓度，当DHA浓度为3、5、7．5和10μmol／L时，BK通道NP。分别为0．6326±0．0478、1．0980±0．0643、1．1587±0．0676和1．1640±0．0926呈浓度依赖性增加（P〈0．05，n=4）。BK通道仪亚单位蛋白表达分别为0．7929±0．1794、0．7760±0．0599和0．7905±0．0596（P〉0．05，n=24），β1亚单位蛋白表达分别为0．8971±0．2976、1．1407±0．1516和1．2392±0．2337（P〉0．05，n=24）。未灌胃组和低、高剂量n-3PUFA灌胃组大鼠冠状动脉平滑肌细胞上BK通道α亚单位基因表达分别为0．6403±0．2470、0．6301±0．2290和0．9217±0．0907（P〉0．05，n=24），B1亚单位基因表达分别为0．8531±0．3687、0．9919±0．2250和1．0865±0．3632（P〉0．05，n=24）。结论n-3PUFA并非通过影响BK通道亚单位表达增加BK通道激活，而是通过与BK通道作用后直接激活，从而扩张冠状动脉。