补肾固冲方逆转Th1/Th2亚群失衡治疗URSA作用与机制研究

目的:探讨Th1/Th2亚群失衡在原因不明性复发性自然流产(URSA)中的作用及补肾固冲方逆转Th1/Th2亚群失衡治疗URSA的作用及分子机制。方法:URSA患者30例,给予补肾固冲方治疗,正常妊娠妇女30例为正常对照组,流式细胞术胞内外双染色法检测URSA患者治疗前后及正常妊娠妇女外周血Th1/Th2亚群分化状态,RT-PCR法检测Th1亚群特异性核转录因子T-bet、Th2亚群特异性核转录因子GATA-3mRNA转录水平。结果:与正常妊娠妇女比较,URSA患者外周血Th1亚群比例显著升高(P<0.05),Th2亚群比例显著降低(P<0.05),Th1/Th2比率显著升高(P<0.05)。补肾固冲方治疗后,URSA患者Th1亚群比例及T-bet转录水平显著降低(P<0.05),Th2亚群比例及GATA-3转录水平显著升高(P<0.05),Th1/Th2比率明显降低(P<0.05)。相关性分析显示,URSA患者治疗后子宫出血天数与Th1亚群比例呈显著正相关(P<0.05),与Th2亚群比例呈负相关,与Th1/Th2亚群呈正相关。结论:URSA患者存在Th1/Th2亚群失衡,补肾固冲方通过上调T-bet转录水平、下调GATA-3转录水平,优势诱导Th2亚群分化,逆转Th1/Th2亚群失衡,进而治疗URSA。

寿胎丸调节树突状细胞功能治疗URSA作用与机制研究

目的:探讨补肾固冲中药复方寿胎丸(STD)调节复发性自然流产患者(URSA)树突状细胞(DC)功能与机制。方法:正常早孕妇女和URSA患者各30例,作为正常对照组和URSA组,后者给予寿胎丸中药治疗。空腹抽取正常对照组及URSA患者治疗前后静脉血,分离单个核细胞,流式细胞术检测CD11c+HLA-DR+、CD11c+CD80+、CD11c+CD86+细胞比例,RT-PCR法检测静脉血HLA-DR、CD80、CD86、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)m RNA转录水平,Western blot法检测IDO蛋白表达,ELISA法检测血清IL-12p70、IL-6蛋白水平。结果:与正常妊娠妇女比较,URSA患者外周血CD11c+HLA-DR+、CD11c+CD80+、CD11c+CD86+细胞比例表达显著升高(P<0.05),HLA-DR、CD80、CD86 m RNA转录水平显著升高(P<0.05),IDO m RNA及蛋白表达明显降低(P<0.05),血清IL-12p70、IL-6蛋白水平显著升高(P<0.01)。与寿胎丸治疗前比较,治疗后URSA患者外周血CD11c+HLA-DR+、CD11c+CD80+、CD11c+CD86+细胞比例及HLA-DR、CD80、CD86 m RNA转录水平表达显著降低(P<0.05),IDO m RNA及蛋白表达明显升高(P<0.05),血清IL-12p70、IL-6蛋白水平显著降低(P<0.01)。结论:URSA患者存在DC数量与功能改变,补肾安胎中药复方寿胎丸能调节DC功能,诱导母胎免疫耐受,治疗URSA。

VPA增强ORI诱导HL-60细胞凋亡及机制研究

目的：探讨VPA与冬凌草甲素（oridonin，ORI）联合诱导HL-60细凋亡的作用及其机制。方法：CCK-8法选取ORI和VPA最佳协同作用剂量；VPA和ORI单独或联合作用于HL-60细胞后，Hoechst33342染色后荧光显微镜下观察细胞核形态学变化；Western blot检测凋亡相关基因caspase-3剪切片段的蛋白表达；预先加入或不加入caspase抑制剂处理HL-60细胞，采用Annexin V／PI流式试剂盒检测两药联合后细胞凋亡的变化。结果：Hoechst33342染色后荧光显微镜下，ORI＋VPA组比单独用药纽核碎裂数目明显增多；ORI和VPA单独作用组caspase-3活性片段表达较对照组高但均不如ORI＋VPA组明显；ORI＋VPA组细胞凋亡率（16．7±2．0）％。与对照组（1．2±1．5）％相比，具有显著差异（P〈0．05）；预先加入caspase抑制剂组细胞几乎没有凋亡，与对照组相比，不具有显著差异（P〉0．05）。结论：VPA确实能增强冬凌草甲素诱导HL-60细胞凋亡，且凋亡机制与caspase凋亡通路密切相关。

2种诱导iPSC向神经干细胞分化方法的比较

目的:整体比较2种促进诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,i PSC)向神经干细胞(neural stem cells,NSC)分化的方法,确定一种稳定、高效的获得NSC的方法,并对NSC进行系统鉴定。方法:方法A:SB431542和drosomophorin的浓度均为5μmmol/L,诱导初始密度100%;方法 B:SB431542的浓度为5 mmol/L,drosomophorin的浓度为1 mmol/L,诱导初始密度为40%。比较及鉴定方法:镜下观察诱导获得NSC的状态;realtime PCR比较神经干细胞相关基因Pax6、nestin、Sox1、Sox2等表达量;流式细胞术分析诱导第16天Pax6阳性率;免疫荧光定性分析神经干细胞相关蛋白的表达及其自发分化的能力。结果:方法 A获得的NSC悬起后成球趋势明显,圆形,透明;方法 B诱导获得NSC形状不规则,色灰暗。Real-time PCR结果证明方法 A诱导获得的细胞神经干细胞相关基因的表达量高于方法 B。流式细胞术分析证明第16天,PAX6的阳性率,方法 A高于方法 B。经鉴定,方法 A获得的神经干细胞高表达Pax6、nestin、Sox2等基因自发分化30 d,形成明显的神经纤维束,表达TUJ-1、MAP2及GFAP等神经元和胶质细胞的特异性标志物。结论:方法 A整体优于方法 B,我们推荐方法 A作为诱导i PSC向神经干细胞分化的方法。

sox4不同结构域的真核表达质粒的构建和鉴定

目的：构建并鉴定sox4四段不同结构域的重组真核表达质粒。方法：以HL-60细胞的总RNA为模板，用RT—PCR方法扩增出sox4基因cDNA，将产物克隆进真核载体pCMV—Flag质粒内，构建含sox4不同结构域的重组真核表达质粒。将pCMV—Flag—sox4重组质粒转染293T细胞，Westernblot检测sox4蛋白表达。结果：核酸序列分析sox4已成功插入pCMV—Flag载体中，转染pCMV—Flag-sox4的293T细胞中检测到表达的sox4蛋白。结论：成功构建了含sox4基因的重组真核表达质粒。

Fas／FasL信号通路在千金子甾醇诱导HL-60细胞凋亡中的作用与机制研究

目的：在明确千金子甾醇诱导HL-60白血病细胞发生凋亡的基础上，从Fas/FasL信号通路的角度探讨其诱导凋亡的分子机制。方法 HL-60细胞培养体系中分别以千金子甾醇终浓度2．5、10、40μg/ml作用24 h后CCK-8法检测千金子甾醇对HL-60细胞增殖的抑制作用，光学及荧光显微镜下观察细胞形态学变化，Annexin Ⅴ/PI 流式细胞术检测细胞凋亡，反转录-聚合酶链反应法检测Fas/FasL、caspase-8和caspase-3 mRNA转录水平，比色法检测caspase-8和caspase-3的相对活性。结果千金子甾醇可明显抑制HL-60细胞的增殖，增殖抑制率分别为（34．9±3．7）％、（54．6±5．2）％、（61．3±4．3）％，细胞呈典型凋亡形态学改变，细胞早期凋亡率分别为（23．4±3．1）％、（35．7±4．3）％、（53．2±3．9）％。Fas、FasL、caspase-8和caspase-3 mRNA转录水平明显上调（P＜0．01），caspase-8和caspase-3活性显著增高（P＜0．01）。结论千金子甾醇可以诱导HL-60细胞发生剂量依赖性细胞凋亡，其机制与上调Fas/FasL凋亡信号通路有关。

Toll样受体与癌症研究进展

Toll样受体（TLR）家族是重要的模式识别受体（PRR），参与固有免疫，调节适应性免疫。TLR表达于免疫细胞及多种恶性肿瘤细胞，识别保守的分子结构，介导炎症、组织损伤及组织修复，在肿瘤的进程中发挥重要作用。对TLR相关信号分子及信号通路的研究结果表明，TLR具有抗肿瘤及促肿瘤双重作用，在肿瘤的预防和治疗方面具有广阔前景。

白藜芦醇对不同乳腺癌细胞增殖的抑制作用

目的探讨白藜芦醇（Res）对雌激素受体（HE）表达不同的3种乳腺癌细胞DU4475、MDA—MB-231和MCF-7增殖、周期和凋亡的影响。方法药物处理组加入终浓度为6．25、12．5、25、50、100、200μmol／L的Res，分别设24、48、72h3个时期。采用噻唑蓝比色法（MTT）法检测Res对乳腺癌细胞增殖的影响，流式细胞术（FCM）检测细胞周期及凋亡，药物浓度为0、12．5、25、50μmol／L。应用统计软件SPSS17．0进行统计学处理。结果经Res作用后，3种乳腺癌细胞增殖均受到不同程度抑制。其中Res作用48h和72h，各浓度对细胞的抑制均有统计学意义（F=15．26，P〈0．05），对ER阴性DU4475和MDA-MB-231细胞株的抑制率均高于ER阳性的MCF-7细胞株。FCM检测结果显示，Res与乳腺癌细胞作用48h，Res浓度在12．5—50μmol／L时，3种乳腺癌细胞周期均被阻滞于S期，阻滞比例差异有统计学意义（F=34．81，P〈0．05），DU4475和MDA—MB-231阻滞于S期的比例高于MCF-7。100μmol／L时，Res对DU4475的促凋亡作用明显强于MCF-7细胞（t=16．082，P〈0．05）。结论Res可抑制以上3种乳腺癌细胞增殖，导致细胞周期改变，促进凋亡。Res对DU4475和MDA—MB-231细胞增殖抑制作用强于ER阳性MCF-7细胞。

趋化因子受体4与肿瘤

趋化因子受体4（CXCR4）属于G蛋白耦联受体超家族，具有趋化免疫细胞、维持免疫细胞的动态平衡等生物学作用。CXCR4表达于多种类型的组织和细胞，在多种肿瘤及肿瘤的不同阶段，CXCR4的表达都明显高于正常组织。CXCR4与肿瘤细胞的增殖、黏附、侵袭和转移有关，在肿瘤的进展中发挥重要作用。

趋化因子受体4与肿瘤

趋化因子受体4（CXCR4）属于G蛋白耦联受体超家族，具有趋化免疫细胞、维持免疫细胞的动态平衡等生物学作用。CXCR4表达于多种类型的组织和细胞，在多种肿瘤及肿瘤的不同阶段，CXCR4的表达都明显高于正常组织。CXCR4与肿瘤细胞的增殖、黏附、侵袭和转移有关，在肿瘤的进展中发挥重要作用。

微小RNA-27 a对黑色素瘤WM239细胞增殖和凋亡的影响

目的：探讨微小RNA-27a（ miR-27a）模拟物和抑制物转染黑色素瘤WM239细胞后对细胞增殖和凋亡的影响。方法将miR-27a模拟物、抑制物及其阴性对照转染WM239细胞，荧光显微镜观察转染效率，实时荧光定量PCR检测相应的微小RNA，四甲基偶氮唑盐（ MTT）法检测细胞增殖，流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期。结果细胞转染效率为80%~90%。转染miR-27a模拟物后，细胞内miR-27a表达量明显上升（2-△△CT值为26.98±0.01），与正常对照组相比差异有统计学意义（ t＝－1123.67，P＝0.00）；转染miR-27a抑制物后，细胞中miR-27a的表达量下降（2-△△CT值为0.96±0.02），与正常对照组相比差异无统计学意义（t＝4.04，P＝0.06）。转染miR-27a模拟物后，细胞增殖受到明显抑制，与正常对照组相比差异具有统计学意义[72 h吸光度（0.45±0.02）∶（0.72±0.01），F＝129.56，P﹤0.05]。miR-27a模拟物组G0-G1期的细胞比例升高[（74.83±1.46）∶（63.73±1.25），F＝30.33，P﹤0.05]，S期和G2-M期细胞比例减少[（21.33±1.75）∶（27.50±1.25），F＝14.98，P﹤0.05；（3.90±1.31）∶（8.80±2.10），F＝3.66，P﹤0.05]；模拟物组细胞凋亡率与正常对照组相比明显增加[（29.67±0.91）%∶（1.44±0.85）%， F＝530.90，P﹤0.01]；而抑制物组对细胞周期和凋亡无明显作用。结论 miR-27a抑制黑色素瘤细胞增殖，具有抑瘤作用，这与其促进细胞凋亡，阻滞细胞周期于G0-G1期相关。