Ezrin的原核表达及与其相互作用蛋白的研究

目的体外筛选人胰腺癌细胞中与Ezrin蛋白相互作用的蛋白。方法提取人胰腺癌Panc-1细胞总RNA,RT-PCR法扩增Ezrin基因。将扩增得到的Ezrin基因片段和pET15b质粒转化E.coli DH5α,获得pET15b-Ezrin重组质粒,双酶切后测序鉴定。将测序正确的重组质粒转化至E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL,以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,对表达产物进行Ni2+-NTA亲和层析和分子筛纯化后,行SDS-PAGE、MALDI-TOF-MS/MS质谱分析和蛋白质印迹鉴定。裂解Panc-1细胞,获得总蛋白提取液,采用Pull-down方法体外筛选与Ezrin重组蛋白相互作用的蛋白,并对筛选出的目的蛋白进行双向凝胶电泳和MALDI-TOF-MS/MS质谱鉴定。结果RT-PCR扩增出的Ezrin基因片段(1761bp)与理论DNA表达片段大小一致,测序鉴定显示克隆的Ezrin基因序列与GenBank报道序列相符。SDS-PAGE、质谱分析和蛋白质印迹分析显示纯化后Ezrin重组蛋白相对分子质量为69400,与质谱分析的相对分子质量结果相符,为带有His-6标签的特异蛋白。双向凝胶电泳和质谱鉴定结果共筛选出可与Ezrin重组蛋白相互作用的7种蛋白,其分别为RNA-binding motif protein39(RBM39)、Transgelin(TAGLN)、Albumin(ALBU)、Formin-1(FMN1)、Rho GTPases(RHGBA)、Tetratricopeptide repeat protein16 (TTC16)、Syntaxin-binding protein1(STXBP1)。结论在大肠杆菌中成功表达、纯化了Ezrin蛋白,并在体外成功筛选出可信的与Ezrin蛋白相互作用的蛋白。

组织工程材料捕获成体干细胞的影响因素研究

目的探索体内埋植组织工程材料方法获取成体干细胞的相关影响因素。方法BALB/c小鼠随机分为2组,分别埋植经环氧乙烷灭菌的明胶海绵与聚乳酸,在植入后第3、7、14天时分别取出材料,HE染色观察细胞捕获情况。将埋植相同质量明胶海绵的小鼠随机分为成骨蛋白-1(OP-1)组、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)组和对照组,在植入后第3、6、9、12、15天时分别取出材料,称取质量并进行细胞计数,采用流式细胞术检测第12天时分离获得的各组细胞表面CD34和干细胞抗原-1(Sca-1)的阳性表达率。另取第12天时分离获得的对照组细胞,分为OP-1组、G-CSF组和空白对照组,采用噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖活性。结果HE染色显示,明胶海绵与聚乳酸捕获的细胞数量均随时间延长而增加。各组植入的明胶海绵质量均随时间延长而减少,而捕获细胞数量均随时间延长而增加,OP-1组第9、12、15天和G-CSF组第9天时捕获细胞数量分别与对照组相比均有统计学意义(均P<0.05);OP-1组细胞表面CD34、Sca-1单阳性表达率和双阳性表达率(分别为13.07%±0.19%、3.98%±0.15%、17.02%±0.12%)均明显高于对照组(分别为11.62%±0.44%、3.03%±0.11%、2.91%±0.14%,均P<0.05),G-CSF组细胞表面CD34、Sca-1单阳性表达率(分别为12.79%±0.39%、4.52%±0.35%)分别与对照组相比均无统计学意义,但双阳性表达率(10.21%±0.15%)与对照组相比有统计学意义(P<0.05)。MTT检测结果显示,OP-1组和G-CSF组各时间点测定的吸光度值均高于空白对照组(均P<0.05)。结论通过体内埋植复合OP-1明胶海绵的方法可增加干细胞的捕获数量,为建立一种简易提取自体干细胞的新方法奠定了基础。

microRNAs参与韧带成纤维细胞成骨分化相关分子表达的调节

韧带成纤维细胞成骨分化与强直性脊柱炎等多种异位骨化相关性疾病有关,但其机制尚不清楚.本研究目的在于观察韧带成纤维细胞在成骨分化过程中microRNA和mRNA的表达谱变化,以期为揭示成纤维细胞成骨分化机制提供研究基础.原代培养韧带成纤维细胞、地塞米松、抗坏血酸和β-磷酸甘油体外诱导其成骨分化,RT-PCR检测成骨标志物骨钙素和Runx2的表达.采用表达谱基因芯片分析诱导0、7、14 d后韧带成纤维细胞的microRNAs和mRNAs表达,并用实时定量PCR(RT-qPCR)和Western印迹方法验证生物信息学分析结果.结果显示,与未诱导前相比,成骨分化第7 d有66个microRNAs和640个mRNA表达上调,94个microRNAs和744个mRNA表达下调;成骨分化第14 d有58个microRNAs和781个mRNA表达上调,96个microRNAs和603个mRNA表达下调.实时定量PCR和Western印迹验证结果显示,miR-29b在成骨分化过程中表达上调,TGFβ3表达水平降低,与芯片结果一致,miR-29b通过抑制TGFβ3蛋白的翻译来促进Runx2的表达,从而促进韧带成纤维细胞向成骨细胞分化.韧带成纤维细胞成骨分化过程中,microRNA调控基因及mRNA差异表达基因除涉及BMPs、Wnt和Ihh等信号通路外,在成纤维细胞成骨分化过程中可能还存在其它的新机制.

乙型肝炎病毒基因型、拉米夫定耐药突变的RFLP检测及临床相关性分析

目的对乙型肝炎(简称乙肝)肝病毒进行基因分型,检测患者服用拉米夫定后血清中乙肝病毒突变情况,并进行临床相关性分析。方法设计乙肝病毒突变及基因分型特异性引物和酶切位点,系用限制性片断长度多态性(RFLP)分析法检测突变类型并对乙肝病毒进行基因分型。结果在115份被检测的血清标本中,75份(65%)标本为野生型,18份(15.7%)标本为YIDD突变,10份(8.7%)标本为YVDD突变;在混合型突变中,YIDD+YVDD存在于6份(5.2%)标本中,YMDD+YIDD存在于4份(3.5%)标本中,2份(1.7%)标本为YMDD+YVDD混合突变型;未检测到YSDD突变型。在180位点的突变检测中,98份(85%)标本为野生型,5份(4.3%)标本为rtL180M,L180M+M204I存在于8份(6.96%)标本中,另4份(3.5%)标本为L180M+M204V混合突变型。在115份标本中,102份标本为C基因型,13份标本为B基因型,未发现其他基因型。通过χ2检验,乙肝病毒YMDD突变与患者的性别、血清DNA水平、病毒基因型之间没有相关性(P>0.05),而乙肝病毒YMDD变异与患者服用拉米夫定的时间长短有相关性(P<0.05),用药时间越长,发生突变的几率越大。乙肝患者服用拉米夫定后,180位点的突变和204位点突变具有相关性(P<0.05)。结论采用RFLP分析法可以有效地检测乙肝病毒YMDD突变并对乙肝病毒进行基因分型。

胰腺癌转移相关基因C14orf166的真核表达及其蛋白相互作用的蛋白质组学筛选

目的旨在对胰腺癌转移相关基因C14orf166进行真核重组表达,并在此基础上结合蛋白质组学方法初步筛选其相互作用蛋白,为进一步研究C14orf166在肿瘤转移中的作用提供研究基础。方法构建人C14orf166的带双标签的真核表达载体pcDNA3.1-Flag-C14orf166-His,通过脂质体将其转染至人胚肾293T细胞。采用Ni-agrose进行His标签蛋白的pull-down纯化,分离C14orf166的蛋白结合复合体,对蛋白混合物进行SDS-PAGE分析,选择差异条带,进行MALDI-TOF-TOF质谱鉴定。结果在293T细胞中重组表达了C14orf166蛋白,对C14orf166蛋白复合体进行分离鉴定后,筛选出RS8、EFCB9和NRAP3个可能与C14orf166相互作用的蛋白。结论基因重组表达结合pull-down和蛋白质组学方法可以发现新的相互作用蛋白,为进一步了解C14orf166在肿瘤发病机制中的作用提供了新的线索。